我的樣本可以用于CUT&RUN嗎?? 四大因素需考量
CUT&RUN技術(shù)使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞核來繪制組蛋白翻譯后修飾(PTMs)和染色質(zhì)相關(guān)蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)的全基因組富集圖譜。在EpiCypher,客戶經(jīng)常會(huì)問,“我的細(xì)胞樣本適用于CUT&RUN技術(shù)嗎? ”盡管大家希望所有細(xì)胞都可以表現(xiàn)出理想的適用性,但事實(shí)并非如此。
在這里,我們將討論EpiCypher在評(píng)估CUT&RUN實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞使用的主要標(biāo)準(zhǔn)。通常情況下,不理想的樣本質(zhì)量=不理想的CUT&RUN數(shù)據(jù)。
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1.細(xì)胞數(shù)量
為了獲得可靠精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),EpiCypher建議在CUT&RUN實(shí)驗(yàn)中每個(gè)反應(yīng)使用500,000個(gè)細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)過程中,我們分兩次對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù):第一次是在最初的細(xì)胞采集時(shí),第二次是將細(xì)胞固定在磁珠上之前。第二次計(jì)數(shù)的目的是確保在使用CUT&RUN緩沖液洗滌過程中沒有大量細(xì)胞樣本的丟失或細(xì)胞裂解的發(fā)生。有關(guān)具體指導(dǎo)信息,請點(diǎn)擊技術(shù)支持中心了解詳情。
CUTANA? CUT&RUN成功將選定的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)減少到5000個(gè)。需要注意的是,使用較低的細(xì)胞數(shù)可能會(huì)降低CUT&RUN產(chǎn)量,所以需要據(jù)此對文庫制備和測序進(jìn)行調(diào)整。如果出現(xiàn)這些情況,請點(diǎn)擊CUT&RUN Library Prep Kit手冊以獲得實(shí)用建議。
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2.細(xì)胞活力
EpiCypher在細(xì)胞收獲時(shí)就會(huì)測定細(xì)胞活力或“活細(xì)胞”的百分比。初始細(xì)胞的活力對于CUT&RUN實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。低活力可能導(dǎo)致分析背景增加、產(chǎn)量降低以及在實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞/磁珠出現(xiàn)聚集的問題。
值得注意的是,細(xì)胞的最佳活力高度依賴于樣本類型。例如,用于CUT&RUN實(shí)驗(yàn)的K562細(xì)胞我們要求在培養(yǎng)收獲時(shí)有>90%的活力。然而,對于其他某些樣品類型或?qū)嶒?yàn)條件,細(xì)胞的最佳活力可能較低。
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關(guān)于細(xì)胞活力和細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的小提示
EpiCypher建議使用簡單的臺(tái)盼藍(lán)染色方法來計(jì)數(shù)細(xì)胞并確定初始細(xì)胞活力。因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)染料對細(xì)胞有毒,所以在添加染料后一定要立即計(jì)數(shù)。
有些細(xì)胞對臺(tái)盼藍(lán)高度敏感。如果細(xì)胞在臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)顯示出較低的活力,但在培養(yǎng)過程中具有預(yù)期的形態(tài)、最小的裂解度且能正常生長,那么這些細(xì)胞可能適用于CUT&RUN技術(shù)。對此,我們建議使用濃度更低的臺(tái)盼藍(lán)染料或嘗試其他細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(如碘化丙啶)來確認(rèn)細(xì)胞活力。
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3.細(xì)胞形態(tài)和完整性
CUT&RUN技術(shù)需要形態(tài)正常的完整細(xì)胞。形態(tài)是指細(xì)胞形狀,與組織來源和/或細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長方式有關(guān)。懸浮細(xì)胞,如K562細(xì)胞,通常來源于血細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞,具有圓形和對稱的形態(tài)。由于貼壁細(xì)胞可以來源于上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)元或成纖維細(xì)胞組織,因此表現(xiàn)出不同的形態(tài)和擴(kuò)增特征。例如,上皮細(xì)胞往往具有均勻的細(xì)胞形狀,可以在細(xì)胞培養(yǎng)板上成片生長,而成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出不對稱、細(xì)長的形態(tài),可用于研究細(xì)胞遷移。
使用裂解或質(zhì)量差的細(xì)胞也會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)質(zhì)量低。為了確保有效的樣品制備,EpiCypher在初始細(xì)胞采集和磁珠結(jié)合之前均會(huì)檢查細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性。第二次檢查很重要,因?yàn)橐恍悠奉愋停ɡ鏔ACS分離的細(xì)胞或來自組織的細(xì)胞)可能對CUT&RUN洗滌緩沖液中的裂解成分更敏感。在這些情況下,我們建議在進(jìn)行CUT&RUN實(shí)驗(yàn)時(shí)分離細(xì)胞核(Figure 1)。
Figure 1: Successful isolated K562 cell nuclei. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.
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4.細(xì)胞來源注意事項(xiàng):細(xì)胞系、原代細(xì)胞、組織和干細(xì)胞
細(xì)胞的形態(tài)、活力和數(shù)量會(huì)直接受到細(xì)胞來源的影響。CUT&RUN實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞可以來自組織、細(xì)胞系、培養(yǎng)的原代細(xì)胞或通過其他方式純化的細(xì)胞(例如FACS)。下面我們將討論這些細(xì)胞樣本的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)。
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√ 永生化細(xì)胞系
示例:HEK293、HeLa、K562、NIH/3T3、MCF-7(Figure 2)、H1299(Figure 3)、A549和THP-1細(xì)胞系。
優(yōu)點(diǎn):一般來說,細(xì)胞系是CUT&RUN技術(shù)中最容易優(yōu)化的input。細(xì)胞系可以提供:
● 大量具有高活力的細(xì)胞——CUT&RUN實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
●?精準(zhǔn)且可高度重復(fù)的CUT&RUN實(shí)驗(yàn)結(jié)果——源于細(xì)胞系的同質(zhì)性。
●?用于藥物篩選、基因過表達(dá)/抑制等的強(qiáng)大系統(tǒng)——不會(huì)破壞樣本質(zhì)量。
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缺點(diǎn):細(xì)胞系的使用有很多注意事項(xiàng),概述如下。而根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,?xì)胞系可能是最佳的來源選擇。
●?一般來說,細(xì)胞系不能代表體內(nèi)條件。它們通常來源于腫瘤細(xì)胞或其他病變細(xì)胞群,與原代細(xì)胞相比,它們的功能可能不同。
●?細(xì)胞系容易發(fā)生基因組改變,包括染色體異常、重復(fù)和/或遺傳漂移。
●?被其他細(xì)胞系污染很常見。錯(cuò)誤細(xì)胞系的鑒定結(jié)果可能會(huì)妨礙測定的重現(xiàn)性,并導(dǎo)致錯(cuò)誤的生物學(xué)結(jié)論。
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Figure 2: MCF-7 breast cancer cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.
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√?原代細(xì)胞
示例:來源于活體組織樣品,固體(如腸、肺、肝、皮膚)或液體(如血液),經(jīng)過或未經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)的均可。?
優(yōu)點(diǎn):原代細(xì)胞經(jīng)常用于CUT&RUN,因?yàn)檠芯空呤褂盟鼈兛梢裕?/span>
●?探究在天然異質(zhì)的細(xì)胞環(huán)境中染色質(zhì)的功能和生物學(xué)機(jī)制。
●?研究通過FACS或其他技術(shù)分離的稀有細(xì)胞的功能狀態(tài)。
●?確定細(xì)胞對體內(nèi)刺激或藥物治療的反應(yīng)。
●?表征患者樣本(例如腫瘤VS.健康細(xì)胞)。
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缺點(diǎn):原代細(xì)胞的缺點(diǎn)取決于研究的組織和細(xì)胞類型。在研究原代細(xì)胞時(shí),可能面臨的挑戰(zhàn)有:
●?分離足夠數(shù)量的細(xì)胞——在分離過程中細(xì)胞的敏感性(如FACS)或在組織中的低豐度。
●?獲得具有高活力的細(xì)胞——原代細(xì)胞通常需要小心處理以防發(fā)生裂解。
●?擴(kuò)大培養(yǎng)——原代細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長能力通常僅限于幾個(gè)階段,需要仔細(xì)規(guī)劃并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)間表。
●?獲得一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果——特別是來源于含有許多不同細(xì)胞類型的大塊組織。
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Figure 3: H1299 non-small cell lung carcinoma cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.
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√?干細(xì)胞
示例:誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn):生長和培養(yǎng)多能干細(xì)胞群和成體干細(xì)胞群的功能使以下研究成為可能:
●?研究細(xì)胞發(fā)育、分化和疾病發(fā)展過程中的表觀遺傳學(xué)變化。
●?生成用于功能分析和治療開發(fā)的稀有細(xì)胞類型。
●?開發(fā)用于個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的患者特異性細(xì)胞群。
●?使用二維細(xì)胞和/或類器官培養(yǎng)研究細(xì)胞的生長和分化。
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缺點(diǎn):盡管干細(xì)胞在細(xì)胞和基因治療研究以及發(fā)育生物學(xué)方面有前景,但干細(xì)胞的研究在許多方面都面臨挑戰(zhàn):
●?干細(xì)胞培養(yǎng)需要豐富的經(jīng)驗(yàn),即便如此,擴(kuò)增某些干細(xì)胞群也很困難。
●?培養(yǎng)干細(xì)胞需要多種質(zhì)控措施和精確的監(jiān)測,成本高且耗時(shí)。
●?不同研究人員之間的分化方案可能會(huì)有所不同,從而引入意想不到的偏差和變化。
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EpiCypher的注冊商標(biāo)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)可見鏈接:https://www.epicypher.com/intellectual-property/。
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本文翻譯自鏈接https://www.epicypher.com/resources/blog/will-my-sample-work-in-cut-and-run/,如與原文有出入的地方,請以英文原文為準(zhǔn)。
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關(guān)于EpiCypher公司:
EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司。從專有組蛋白肽陣列平臺(tái)EpiGold?開始,EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時(shí),EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)導(dǎo)者。利用其獨(dú)有技術(shù),不斷增加產(chǎn)品庫中高純度修飾重組核小體(dNucs?)產(chǎn)品。dNuc?多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。
EpiCypher還將dNuc?技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中,包括:SNAP-ChIP?Spike-in Controls(用于抗體分析和ChIP定量), EpiDyne?底物(用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)),dCyher?測定(用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用)。最近,EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA?分析。
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