MoDC制備方法簡圖

背景

DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細(xì)胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由 2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家 Ralph M. Steinman 于1973 年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細(xì)胞 (Antigen Presenting Cells, APC) 。已證實，DC 是唯一能夠顯著刺激初始 T 細(xì)胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它種類的APC ( 如單核巨噬細(xì)胞，B 細(xì)胞等) 僅能刺激已活化的或記憶性的 T 細(xì)胞，因此 DC 是機體適應(yīng)性 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。

DC 培養(yǎng)原理

因為DC需從其它種類細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來，且可分為不同的成熟階段，所以通常分為2個步驟進(jìn)行培養(yǎng)：

Step 1：從DC的祖細(xì)胞(如單核細(xì)胞) 誘導(dǎo)分化為未成熟DC(immature DC， iDC) ；

Step 2：從iDC誘導(dǎo)分化為成熟DC(mature DC， mDC) 。

Step 1：

GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)

GM-CSF是一種造血生長因子， 在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落的形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF是最早被鑒定出對DC培養(yǎng)有作用的細(xì)胞因子之一。

GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化， 細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)得以提高， 從而增強細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外， GM-CSF也有助于DC的存活。

IL-4(白細(xì)胞介素-4)

IL-4在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC的過程中可抑制巨噬細(xì)胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。同時、IL-4還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14分子的能力。CD14表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC的重要標(biāo)志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC， 此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力， 但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá)MHC I類、Ⅱ類分子和B7家族分子(CD80，CD86等)，但不表達(dá)或低表達(dá)CD14。

Step 2：

TNF-a/IL-1β/IL-6(腫瘤壞死因子-a/白細(xì)胞介素-1β/白細(xì)胞介素-6)

TNF-a， IL-1β和IL-6均為促炎癥因子， 在感染局部和腫瘤部位被誘導(dǎo)產(chǎn)生。體外研究表明，這3種細(xì)胞因子均可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHCⅡ類分子區(qū)室(class II compartment) 消失， 但能夠上調(diào)細(xì)胞表面MHC I類、Ⅱ類分子和B7家族分子(CD80，CD86等)的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強地激活Ｔ細(xì)胞。

TNF-o/IL-1β/IL-6三因子組合可在無牛血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)DC的完全成熟， 從而制備出可以應(yīng)用于臨床的DC。

·PGE 2(prostaglandin E 2， 前列腺素E 2)

PGE 2也是炎性介質(zhì)， 可由TNF-a， IL-1和LPS(脂多糖) 等炎癥信號誘導(dǎo)產(chǎn)生。在TNF-a/IL-1B/IL-6成熟誘導(dǎo)組合中添加PGE 2， 可進(jìn)一步提高DC的產(chǎn)量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力。

這里尤為重要的是DC遷移能力的提高。因為TNF-0/IL-1B/IL-6誘導(dǎo)成熟的DC遷移能力較弱， 不能很好地到達(dá)淋巴結(jié)而激活T細(xì)胞。而添加PGE 2后誘導(dǎo)成熟的DC因表面趨化因子受體的高表達(dá)，更容易遷移至淋巴結(jié)，從而引起機體對抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

因此， TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE 2組合(見下表) 廣泛應(yīng)用于臨床， 并被認(rèn)為是制備成熟DC的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

注意事項

1.DC的來源

DC有多種來源， 包括外周血單核細(xì)胞(Monocyte) 、臍帶血CD 34*細(xì)胞、骨髓和胎肝等，但因外周血單核細(xì)胞最容易獲取、數(shù)量也最多，所以臨床上被廣泛用作DC的來源細(xì)胞。

2.DC的成熟度：

我們知道， DC有未成熟和成熟兩種狀態(tài)， 即iDC和mDC， DC的抗原遞呈能力 與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)。

iDC的抗原攝取和加工能力較強， 但抗原遞呈能力很弱。在體外培養(yǎng)時， iDC去除細(xì)胞因子(即GM-CSF和IL-4) 后， 會逆轉(zhuǎn)為巨噬細(xì)胞。且即使在細(xì)胞因子的維持下， 未成熟DC的功能也不是激活T細(xì)胞，而是抑制T細(xì)胞的增殖。

mDC則正好相反， 其抗原攝取和加工能力很弱， 但具有很強的抗原遞呈能力。因而可以激活T細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)。而且DC成熟后即使在培養(yǎng)體系中去除細(xì)胞因子，仍能保持DC的狀態(tài)和功能，不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

因此可以看出，DC必須完全成熟后才能用于免疫治療。

3.DC的無牛血清培養(yǎng)：

DC最初都是在含有小牛血清(Fetal Calf Serum， FCS) 的培養(yǎng)體系中獲得的， 但我們知道， 如果想將DC應(yīng)用于臨床治療， 則不能使用FCS。然而如果不用FCS，DC則無法培養(yǎng)成功。

科學(xué)家最先想到的是用10%的人自體血漿來替代10%的FCS， 但實驗結(jié)果表明， 人單核細(xì)胞在含10%人自體血漿的培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)7天后， 大多數(shù)單核細(xì)胞仍貼壁， 半懸浮的iDC數(shù)量非常少。后來經(jīng)過不斷摸索發(fā)現(xiàn)， 在無血清培養(yǎng)基中添加1%人自體血清對于從單核細(xì)胞誘導(dǎo)成為iDC效果最好。

更為困難的步驟是如何在無牛血清培養(yǎng)體系中將iDC誘導(dǎo)成為mDC。

TNFα-和IL-1β在含牛血清培養(yǎng)體系中均是很好的DC成熟誘導(dǎo)劑， 而在無牛血清培養(yǎng)體系中， 兩者均無效或效果微弱。即在無牛血清培養(yǎng)體系中， TNF-Q和IL-1β不能將iDC誘導(dǎo)成為mDC， 或僅能誘導(dǎo)一小部分iDC成為mDC。

后來的研究表明， 用單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Monocyte-conditioned medium， MCM) ，即單核細(xì)胞在包被有免疫球蛋白的細(xì)菌平皿上無牛血清培養(yǎng)24小時后得到的培養(yǎng)上清，可在無牛血清培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)DC的完全成熟。因此認(rèn)為， 1%人自體血漿+MCM可能成為臨床上獲得成熟DC的標(biāo)準(zhǔn)方法。

但每次制備的MCM的一致性很難保證， 導(dǎo)致每批MCM必須經(jīng)過測試后才能確定最適用量， 這給臨床應(yīng)用帶來阻力和不穩(wěn)定性。所以， 人們一直想尋找到能夠替代MCM的化學(xué)成分明確的成熟誘導(dǎo)組合。

1997年， 德國美因茨大學(xué)(Mainz University) 的Jon ule it等取得了突破性進(jìn)展， 他們發(fā)現(xiàn)TNF-Q， IL-1β和IL-6三種細(xì)胞因子的組合可完全替代MCM， 在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)DC誘導(dǎo)成完全成熟的DC。

4.PGE 2與DC：

德國美因茨大學(xué)的Jon ule it在證明TNF-α， IL-1β和IL-6三種促炎癥因子的組合可完全替代MCM， 在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)DC完全誘導(dǎo)成熟的同時， 也發(fā)現(xiàn)另一種炎癥介質(zhì)， 即PGE 2可進(jìn)一步提高DC的產(chǎn)量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力。也就是說在TNF-u， IL-1β和IL-6之外添加PGE 2可獲得更為成熟和高效的DC， 這樣會提高臨床上DC的治療效果。

PGE 2常被加入DC成熟誘導(dǎo)組合中最重要的原因是其可提高成熟DC的遷移能力，這樣可使DC更容易到達(dá)淋巴結(jié)，從而引起免疫反應(yīng)、治療腫瘤但我們也應(yīng)該注意以下幾點：

1) PGE 2不能添加到DC誘導(dǎo)分化的Step 1中， 如加入， DC的分化將會被抑制。

2) 我們知道， 能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生Thl反應(yīng)的DC(很多文獻(xiàn)中稱為DC 1) 有助于多種腫瘤，如黑色瘤和惡性膠質(zhì)瘤等的治療。

實驗研究表明， 在成熟誘導(dǎo)因子(TNF-α/IL-1β) 中加入PGE 2傾向于將iDC誘導(dǎo)成為成熟的DC 2， 而非DCI， 該DC會誘導(dǎo)產(chǎn)生Th 2反應(yīng)。所以很多人試圖尋找能夠誘導(dǎo)DC 1的最佳成熟誘導(dǎo)組合， 如TNF-α/IL-1β/IFN-0/IFN-y/poly-I：C，TNF-α/IL-1B/IFN-y/PGE 2(低濃度) /R 848(TLR 7/8激動劑) 和IFN-y/LPS序貫組合等，但這些新組合都未得到臨床上的充分驗證，也就沒有真正用于臨床級別DC的制備。

3) 其實， 各家的研究結(jié)果不盡相同。比如， TNF-0/IL-1B/IL-6/PGE 2組合的創(chuàng)立者--德國美因茨大學(xué)的Jon ule it在研究時就發(fā)現(xiàn)， 添加PGE 2誘導(dǎo)成熟的DC在刺激T細(xì)胞時可顯著提高其分泌的IFN-y產(chǎn)量， 而對IL-4和IL-10的分泌無影響，提示添加PGE 2誘導(dǎo)成熟的DC具有誘導(dǎo)Thl反應(yīng)的傾向。

總之，培養(yǎng)體系中是否加入小牛血清，以及所使用的無血清培養(yǎng)基種類不同等諸多因素都可能導(dǎo)致添加PGE 2誘導(dǎo)成熟的DC在性質(zhì)上的差異， 因此臨床上制備DC時最好能夠做充分的前期研究，然后確定用于治療某種腫瘤最好的制備方法。

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