LIF的英文全稱為Leukemia?Inhibitory?Factor，中文譯為白血病抑制因子，其為一種具有多種功能的細(xì)胞因子，但其最重要的應(yīng)用是維持小鼠胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。為幫助您更好的選擇和使用LIF，特與大家分享此文。?
LIF從發(fā)現(xiàn)、克隆到現(xiàn)在(2013年)已經(jīng)有25年的歷史了，與PeproTech公司同齡(PeproTech公司成立于1988年，今年是其25周年慶)。那么LIF是如何被發(fā)現(xiàn)的呢？這要從白血病的治療說起 ----我們知道，正常的血液細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞。存在于骨髓或外周血等處的微量造血干/祖細(xì)胞經(jīng)過增殖和分化后可成為成熟的血液細(xì)胞，以不斷補充死去的成熟血液細(xì)胞。如果造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化過程受到異常調(diào)節(jié)，這些細(xì)胞將停留在幼稚的細(xì)胞階段，而數(shù)目仍在不斷增加，這就是白血病的成因。因此，白血病是造血細(xì)胞的增殖和分化過程失去正常的控制而形成的?？茖W(xué)家一直在尋找能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞分化，同時又能抑制其增殖的細(xì)胞因子或藥物，以期治療白血病[1]。
19世紀(jì)80年代已發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子，如G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)，Multi-CSF(即現(xiàn)在的IL-3)和IFN-g(干擾素-?g)等。這些細(xì)胞因子的共同特點是：既能促進(jìn)造血細(xì)胞的分化，又能刺激它們的增殖。這就帶來一個問題，即這些細(xì)胞因子在促進(jìn)白血病細(xì)胞分化的同時，也會大量增加白血病細(xì)胞的數(shù)量，這樣可能會加重白血病的病情，而不是治療白血病。所以，科學(xué)家試圖仍然需要找到一種只誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，但不促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子來治療白血病。
1969年在從SL品系小鼠的自發(fā)髓系白血病體外建系(即后來我們所熟知的小鼠M1髓系白血病細(xì)胞系，常用于重組LIF蛋白的生物活性檢測)的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞的培養(yǎng)液可誘導(dǎo)M1白血病細(xì)胞系分化為成熟的巨噬細(xì)胞或粒細(xì)胞。研究人員將培養(yǎng)液中的這些未知的誘導(dǎo)成分統(tǒng)稱為Differentiation?Stimulating?Factor,?即分化刺激因子，簡稱D-factors?(D-因子)[2]。
1981年[3]年和1984年[4]科學(xué)家分別從小鼠Krebs肉瘤細(xì)胞和小鼠?L929成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液中鑒定出MGI-2(Macrophage?and?Granulocyte?Inducing-2,?巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞誘導(dǎo)-2)和一種D-因子，兩者均可誘導(dǎo)小鼠M1髓系白血病細(xì)胞的分化，而不刺激正常造血細(xì)胞的增殖。
緊接著在1987年，澳大利亞皇家墨爾本醫(yī)院沃爾特與伊麗莎醫(yī)學(xué)研究所(Walter?and?Eliza?Hall?Institute?(WEHI),?Royal?Melbourne?Hospital)的Donald?Metcalf實驗室從小鼠Krebs肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出可以誘導(dǎo)小鼠M1髓系白血病細(xì)胞分化的蛋白，因該蛋白具有抑制M1髓系白血病細(xì)胞增殖的作用，因而被命名為白血病抑制因子，即Leukemia?Inhibitory?Factor?(LIF)。同時發(fā)現(xiàn)，該蛋白不能刺激正常髓系前體細(xì)胞的增殖。?Donald?Metcalf等認(rèn)為LIF與前面所發(fā)現(xiàn)的MGI-2和D-因子是同一種物質(zhì)，因他們最大的共同點是均可誘導(dǎo)小鼠M1髓系白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化。至此，LIF蛋白被正式發(fā)現(xiàn)和命名，MIG-2和D-因子為其別名。隨后，Donald?Metcalf實驗室分別于1987年和1988年克隆出表達(dá)小鼠LIF和人LIF的基因[5,6]。
LIF的發(fā)現(xiàn)似乎給人們治療白血病帶來希望。然而深入的研究發(fā)現(xiàn)，LIF的作用非常廣泛，即使對于白血病細(xì)胞系，也是有些抑制，有些促進(jìn)。因此，LIF與其它多功能的細(xì)胞因子，如TNF-a等相似，很難應(yīng)用于臨床。這些年來，LIF頗受關(guān)注。血液學(xué)家、神經(jīng)生物學(xué)家、肌肉細(xì)胞生物學(xué)家、骨生物學(xué)家、內(nèi)分泌生物學(xué)家和生殖生物學(xué)家都在研究LIF，可惜沒人能夠做深[7]。LIF目前最廣泛的應(yīng)用還是在實驗室里用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，這在后面會詳述。
?
?LIF怎么和小鼠胚胎干細(xì)胞（Murine Embryonic Stem Cell,mES）的培養(yǎng)聯(lián)系上的呢？ |
LIF因為可抑制小鼠M1白血病細(xì)胞的增殖而得名，那么科學(xué)家又是如何發(fā)現(xiàn)其在mES培養(yǎng)中的重要作用呢？科研充滿了巧合，但需要敏銳和發(fā)散性的思維去感觸這種巧合。
1981年劍橋大學(xué)的Martin?Evans，Matthew?Kaufman和美國加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的Gail?Martin等首先從小鼠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(Inner?Cell?Mass,?ICM)中獲得小鼠胚胎干細(xì)胞(mES)[8,9]的時候，必須在飼養(yǎng)層細(xì)胞(feeder?cells)上進(jìn)行培養(yǎng)，否則mES就會自發(fā)分化。
為分析飼養(yǎng)層細(xì)胞抑制mES分化的機制，人們從飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離出能夠抑制mES分化的成分[10,11]。但這些成分的抑制分化作用均弱于英國愛丁堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院(University?of?Edinburgh?Medical?School)的Austin?Smith于1986年從Buffalo大鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離出來的DIA(differentiation-inhibiting?activity)，即分化抑制活性蛋白[12]。后來，Austin?Smith轉(zhuǎn)到英國牛津大學(xué)工作，并繼續(xù)研究DIA。1988年與美國Genetics?Institute公司合作，Austin?Smith在探討DIA是否可作用于ES細(xì)胞以外的細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)DIA能夠維持DA-1a?(小鼠IL-3依賴的白血病細(xì)胞系)的持續(xù)生長[13]。湊巧的是，美國Genetics?Institute公司新近剛克隆出一個能維持DA-1a細(xì)胞生長的造血生長因子基因，命名為HILDA(Human?Interleukin?for?DA?cells)。更重要的是，序列分析發(fā)現(xiàn)，HILDA基因與澳大利亞Donald?Metcalf實驗室于同一年剛剛克隆出來的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致，也就是說HILDA就是LIF[14]。美國Genetics?Institute公司的這兩個工作連續(xù)發(fā)表在Nature雜志1988年的同一期中。
鑒于DIA和HILDA/LIF均能夠維持DA-1a的生長，Austin?Smith就在想，HILDA/LIF是否也能和DIA一樣能夠抑制mES的分化。結(jié)果是令人振奮的！即將HILDA/LIF基因克隆進(jìn)入非洲綠猴COS腎細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，COS細(xì)胞的培養(yǎng)上清可抑制mES細(xì)胞的分化。而且，考慮到DIA蛋白與HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推測，DIA應(yīng)該就是LIF[13]。
上面的研究最重要的是發(fā)現(xiàn)了LIF可能就是能夠抑制mES分化的DIA，也揭示了LIF對不同細(xì)胞系具有不同的作用，甚至是截然相反的作用。對小鼠M1白血病細(xì)胞，LIF可促進(jìn)其分化，而對于mES，LIF則抑制其分化。
估計國外科學(xué)家之間的溝通是非常多和及時的。同期，發(fā)現(xiàn)小鼠和人LIF的澳大利亞Donald?Metcalf實驗室也敏銳地意識到DIA與LIF的相似性，并證實LIF(無論是人LIF，還是小鼠LIF)能維持mES的未分化狀態(tài)[15]，該研究結(jié)果與美國Genetics?Institute公司的兩個工作發(fā)表在1988年Nature雜志的同一期上。也就是說，Nature雜志1988年的同一期連續(xù)刊登了3篇關(guān)于LIF的文章，且都是講LIF與mES細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)系，可見LIF在mES細(xì)胞培養(yǎng)中的重要性。
因此在1988年底，也就是人的LIF剛剛被克隆出來的時候，人們就將目光轉(zhuǎn)向了LIF在mES培養(yǎng)中的作用。此后，沒人再去驗證DIA與LIF是否真為同一種物質(zhì)，因只要得到了一種能夠強力抑制mES分化的因子(即LIF)就足夠了。
?
?培養(yǎng)mES(小鼠胚胎干細(xì)胞)，應(yīng)該用人的LIF(human?LIF,?hLIF)，還是小鼠的LIF(murine?LIF,?mLIF)? |
培養(yǎng)mES究竟是應(yīng)該用mLIF，還是hLIF，要從以下三個方面來考量：
1) 性能
hLIF和mLIF的發(fā)現(xiàn)者--澳大利亞Donald?Metcalf實驗室研究證實，hLIF對小鼠M1髓系白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力與mLIF相同或更好[6]，也就是說hLIF完全可以替代mLIF來培養(yǎng)小鼠細(xì)胞。
更重要的是，1988年Donald?Metcalf在Nature上饌文專門比較了hLIF和mLIF在維持mES細(xì)胞未分化狀態(tài)的能力，發(fā)現(xiàn)兩者完全一致，且最適用量均為1000?units/ml[15]。
有趣的是，hLIF可完全替代mLIF作用于小鼠細(xì)胞，但反過來，mLIF卻對人的細(xì)胞無效。這是什么原因呢？
研究表明，hLIF可與小鼠細(xì)胞上的mLIF受體(mLIF-R)結(jié)合，且親合力高于mLIF與mLIF受體的結(jié)合，這可能是hLIF對小鼠M1髓系白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力比mLIF更好的原因。而mLIF不能與人細(xì)胞上的hLIF受體(hLIF-R)結(jié)合。?所以mLIF不能用于培養(yǎng)人的細(xì)胞[16]。
綜上所述，hLIF和mLIF在培養(yǎng)mES上的性能完全相同，可以相互替代，也就是說，完全可用hLIF來培養(yǎng)mES。
2) 價格
hLIF和mLIF的價格相差很大，主要原因是mLIF屬于專利產(chǎn)品，為一家公司獨有，其價格要高出hLIF?2-3倍之多。
Donald?Metcalf等發(fā)現(xiàn)mLIF和hLIF，以及后期有關(guān)LIF的研究工作都是在澳大利亞AMRAD公司的資助下進(jìn)行的，因此在后來申請專利時，發(fā)明者(Inventors)是Donald?Metcalf實驗室的人員，但受讓人(Assignee，即專利的持有者)是澳大利亞AMRAD公司。后來，AMRAD公司自己在研制LIF藥物，而將mLIF的專利權(quán)授權(quán)給另外一家公司僅用于科學(xué)研究。
從表1中可以看出，hLIF比mLIF便宜很多，且有大包裝以及無動物成分(Animal?Free)的hLIF可供選擇，因此從性價比考慮，培養(yǎng)mES最好用hLIF。
?
表1：人LIF和小鼠LIF的比較 |
| ?hLIF?(人LIF) | ?mLIF?(小鼠LIF) |
?氨基酸數(shù)目 | ?180 | ?180 |
?氨基酸序列一致性 | ?78% |
|
?分子量(非糖基化) | ?19.6kD | ?20kD |
?糖基化程度 | ?非常高 |
|
?糖基化與生物活性的關(guān)系 | ?無 |
|
?生物學(xué)活性 | ?對人和小鼠細(xì)胞的生物學(xué)活性完全相同 | ?僅能作用于小鼠細(xì)胞 |
?培養(yǎng)mES的工作濃度 | ?1,000?units/ml?或10ng/ml |
|
?價格 | ?以PeproTech公司的hLIF為例?
?(產(chǎn)品編號：300-05)： | ?專利擁有公司的產(chǎn)品編號分別為LIF2005和
?LIF2010： |
| ?960元/5ug | ?2071元/5ug |
| ?2340元/25ug
?9,800元/100ug | ?3077元/10ug
?12,987元/ESG1107 |
?大包裝 | ?有250ug,?500ug和1mg等其它大包裝供選
?擇。包裝越大，相對單位成本越低。 | ?無 |
?無動物成分蛋白 | ?有，產(chǎn)品編號為AF-300-05 | ?無 |
?
3) 與其它動物的交叉反應(yīng)
我們知道，目前商品化的LIF以人和小鼠為主，其它種屬的LIF很難買到。因此，如果您除了研究小鼠的ES(胚胎干細(xì)胞)或iPS(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)，同時還研究其它動物，如牛、豬、犬、羊的ES或iPS，則不得不選用hLIF或者mLIF。
究竟是應(yīng)該用hLIF，還是mLIF呢？國際上的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)hLIF和mLIF與其它種屬動物L(fēng)IF的同源性高低來確定。表2顯示，hLIF與牛、豬、犬、羊的LIF的氨基酸序列一致性均明顯高于mLIF，因此國際上通常用hLIF來培養(yǎng)這些動物的ES或iPS[17-20]。
?
表2：人LIF和小鼠與其它種屬LIF的氨基酸序列一致性 |
| ?hLIF?(人LIF) | ?mLIF?(小鼠LIF) |
?牛(Bovine) | ?88% | ?76% |
?豬(Porcine) | ?87% | ?78% |
?犬(Canine) | ?91% | ?80% |
?羊(Sheep) | ?89% | ?77% |
總而言之，從性價比以及與其它種屬的交叉反應(yīng)來考慮，用hLIF是明智的選擇。
?
?奇怪的現(xiàn)象：hLIF對mES有效，而對hES(human?ES，即人ES)的培養(yǎng)無效? |
ES細(xì)胞的獲得比mES晚了整整17年。?1998年，美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的James?Thomson和約翰?霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Shamblott等首先分別從人ICM(Inner?Cell?Mass，內(nèi)細(xì)胞團)?和PGCs?(Primordial?germ?cells，原始生殖細(xì)胞）成功地建立了hES?細(xì)胞系[21,?22]，從而開啟了對hES的科研和臨床研究。
依培養(yǎng)mES的經(jīng)驗，在最初hES細(xì)胞的培養(yǎng)體系中也加入了hLIF以抑制hES的分化。但結(jié)果與預(yù)期的相悖，即hLIF無法維持hES細(xì)胞的未分化狀態(tài)。原因何在？
最初，人們推測hLIF不能抑制hES分化的原因是hES細(xì)胞表面缺乏hLIF的受體[23]。但美國加州大學(xué)圣地亞哥分校(UCSD)的Rohan?Humphrey于2004年證實hES細(xì)胞上存在hLIF的受體，且hLIF與hES上的受體結(jié)合后可以激活JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑[24]。理論上如果JAK/STAT3信號傳導(dǎo)途徑被激活了，應(yīng)該與hLIF或mLIF作用于mES相似，hES也應(yīng)該保持未分化狀態(tài)。但結(jié)果確是，hES仍然會分化。所以該文作者認(rèn)為，hES細(xì)胞的分化狀態(tài)與hLIF是否激活hES細(xì)胞的JAK/STAT3信號傳導(dǎo)途徑無關(guān)。
其實，不單是hES，LIF對猴(rhesus?monkey)和兔(Rabbit)的ES也無效[25,?26]。?問題是，什么因子可抑制這些種屬ES(包括人、猴和兔的ES)的分化呢？答案是FGF-basic，即堿性成纖維細(xì)胞生長因子，又稱FGF-2。文獻(xiàn)[26-29]對FGF-basic在維持這些ES細(xì)胞未分化狀態(tài)中的作用進(jìn)行了詳述。
?
?
mES(小鼠胚胎干細(xì)胞)的維持培養(yǎng)液?(有飼養(yǎng)層培養(yǎng))
(以配制500ml?mES培養(yǎng)液為例。按下表配制，配制后，4oC可儲存2周) |
?組分 | 貯存液濃度 | 終濃度 | 終體積 |
DMEM培養(yǎng)液(高糖) | 100% |
| 410?ml |
FBS(胎牛血清) | 100% | 15% | 75?ml |
L-谷氨酰胺 | 200?mM | 2?mM | 5?ml |
非必需氨基酸(NEAA) | 10?mM | 0.1?mM | 5?ml |
丙酮酸鈉 | 100?mM | 1?mM | 5?ml |
b-巰基乙醇 | 14.3?M | 0.1?mM | 3.5?ml |
LIF | 50mg/ml | 10?ng/ml | 0.1?ml |
注：mES對FBS的質(zhì)量非常敏感，請務(wù)必使用ES細(xì)胞驗證過的FBS |
?
mES(小鼠胚胎干細(xì)胞)的維持培養(yǎng)液?(有飼養(yǎng)層培養(yǎng))
(以配制500ml?mES培養(yǎng)液為例。按下表配制，配制后，4oC可儲存2周) |
?組分 | ?貯存液濃度 | ?終濃度 | ?終體積 |
?DMEM-F12培養(yǎng)液 | ?100% |
| ?390?ml |
?KOSR(血清替代物) | ?100% | ?20% | ?100?ml |
?L-谷氨酰胺 | ?200?mM | ?2?mM | ?5?ml |
?非必需氨基酸(NEAA) | ?10?mM | ?0.1?mM | ?5?ml |
?b-巰基乙醇 | ?14.3?M | ?0.1?mM | ?3.5?ml |
?FGF-basic | ?20?mg/ml | ?4?ng/ml | ?0.1?ml |
?
?hES(人胚胎干細(xì)胞)的維持培養(yǎng)液（無飼養(yǎng)層培養(yǎng)） |
為保證培養(yǎng)的最佳效果，最好使用商品化的hES無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液，如PeproTech公司的PeproGrow-ESC人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，其優(yōu)點為：
●?世界上唯一不含酚紅(phenol?red)和胰島素(insulin)的人胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液。(酚紅會影響活細(xì)胞成像，并可能因具有潛在的雌激素作用而影響胚胎干細(xì)胞的正常功能[30,31]，而培養(yǎng)基中的胰島素則會干擾對由胚胎干細(xì)胞分化而成的胰島素分泌細(xì)胞的檢測)
●?含高品質(zhì)的重組生長因子(FGF-basic和TGF-b1等)
●?極具競爭力的價格
●?細(xì)胞鋪板率高
●?與美國Rutgers(羅格斯)大學(xué)干細(xì)胞培訓(xùn)中心合作開發(fā)，并在該中心的培訓(xùn)教程中使用
?
PeproGrow-hESC 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液 |
?PeproGrow-hESC | ?產(chǎn)品編號：BM-hESC | ?500mL | ?2800元 |
?PeproGrow-hESC | ?產(chǎn)品編號：BM-hESC | ?100mL | ?1120元 |
?應(yīng)用范圍：用于體外，不能用于診斷或治療 |
?