DC-CIK 細胞的制備方法

2021-05-08

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CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞”。CIK 是單個核細胞在CD3 單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK 細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK 細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
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? DC?是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman 于1973 年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實，DC 是唯一能夠顯著刺激初始T 細胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它種類的APC(如單核巨噬細胞，B 細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T 細胞，因此DC 是機體適應(yīng)性T 細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。

? ? DC-CIK 即DC 和CIK 細胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴格的說，最終的效應(yīng)細胞是經(jīng)DC 體外活化的CIK 細胞。多項研究表明，DC 與CIK 具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC 表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK 的增殖能力和體內(nèi)外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK 較單獨的CIK 治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC 與CIK 共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T 細胞，這樣的DC-CIK 治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC 刺激活化的CIK 活性更強，常被用于臨床和科研。

【步驟簡圖】

【培養(yǎng)原理】

1．DC?培養(yǎng)用細胞因子：

GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)：

GM-CSF 是最早被鑒定出對DC 培養(yǎng)有作用的細胞因子之一，在DC 培養(yǎng)中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II 類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF 也可促進DC 的存活。

IL-4 (白細胞介素-4)

IL-4 在由單核細胞誘導(dǎo)成DC 的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細胞向DC 方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4 還有降低細胞表面表達CD14 分子的能力。CD14 表達水平的降低是單核細胞分化為DC 的重要標志。

TNF-α (腫瘤壞死因子-α)

TNF-α可下調(diào)未成熟DC 的巨胞飲作用和表面Fc 受體的表達，使細胞內(nèi)MHC II 類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細胞表面MHC I 類、II 類分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表達，使未成熟DC 分化為成熟DC(mature DC)，此時DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強的激活T 細胞。

2. CIK 培養(yǎng)用細胞因子和抗體：

CD3 激發(fā)型單抗：

CD3 分子在T 細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā)型單抗與T 細胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致T 細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T 細胞增殖和活化。也就是說，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識別和激活過程，從而引起T 細胞的增殖與活化，因此是CIK 細胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。

，CD3 激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細胞的增殖，而其它克隆號的CD3 激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T 細胞。因此，在進行CIK 培養(yǎng)時，最好選用OKT-3 克隆，以保證每個患者的T 細胞均能被激活。

IL-2 (白細胞介素-2)
IL-2 最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T 細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2 既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2 還可刺激NK 細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK 細胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進T 細胞的增殖與活化。

IFN-γ (干擾素-γ)
IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強度。在誘導(dǎo)CIK細胞形成的過程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。

IL-1α(白細胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型CD3 單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。

【細胞制備】

1．外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)。
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2 次，獲得純度在90%以上的PBMC，細胞數(shù)量需達到 1-3 x108。

2． (可選步驟) 腫瘤抗原的制備

? ? 用于負載DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。

? ? 用TSA 或TAA 負載的DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全細胞抗原負載DC 可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的TSA 或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC 可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的細胞毒T 淋巴細胞(CTL)克隆，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的有效殺傷。
? ? 腫瘤細胞全抗原負載DC 的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。反復(fù)凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1 手術(shù)切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2 無菌生理鹽水洗3 次；
2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，充分研磨；
2.4 200 目無菌網(wǎng)過濾后收集單細胞懸液；
2.5 用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml 無菌凍存管中；
2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入37oC 水浴中解凍10 min。
反復(fù)3-5 次；
注：也可以-80oC/37oC 反復(fù)凍融3-5 次。
2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
2.8 收取上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
2.9 -80oC 保存?zhèn)溆谩?/span>

3． CIK 細胞的培養(yǎng)及鑒定
3.1 步驟1 中獲得的PBMC 用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；
3.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁;
3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養(yǎng)；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml 的重組人IL-1α。
3.6 每3 天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
3.7 在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK 細胞，此時數(shù)量應(yīng)達到1x 109 個以上。
3.8 CIK 細胞質(zhì)控：
3.8.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
3.8.2 用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8 和CD56 等分子的表達，觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。

4． DC 細胞的培養(yǎng)及鑒定
4.1 步驟3.2 中剩下的貼壁細胞(主要是CD14+的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF500-1,000U/ml 和重組人IL-4 500U/ml 的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細胞向DC 細胞分化；
4.2 每3d 半量換液一次，并補足細胞因子；
4.3 (可選步驟) 在培養(yǎng)的第5d，加入步驟2 中獲得的腫瘤抗原50 μg/ml，對DC 進行抗原負載；
注：若不對DC 進行抗原負載，該步省略。
4.4 在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-α(500U/ml)，誘導(dǎo)DC 細胞成熟；
4.5 在培養(yǎng)的第7d 或第8d，收獲DC 細胞，其數(shù)量應(yīng)達到1×106 個以上；
4.6 DC 的質(zhì)檢：
4.6.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
4.6.2 流式細胞儀檢測DC 細胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達，以確定DC 是否成熟。

5. DC-CIK 細胞的制備和質(zhì)檢
5.1 收集步驟4 和步驟3 中所獲得的DC 細胞和CIK 細胞，按1∶10 (數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3 天半量換液一次，并補加重組人IL-2 (300U/ml)。
5.3 在第7d 收集細胞，細胞數(shù)量應(yīng)達到1×1010 個以上；
5.4.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
5.4.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應(yīng)在20%以上。
5.4.3 細胞殺傷實驗：以DC-CIK 細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 104 個，終體積為200 μl，設(shè)3 個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。
5.4.4 收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標準：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【DC-CIK?培養(yǎng)試劑推薦】

DC-CIK 細胞的制備方法

注：Animal Free 意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產(chǎn)過程中不會有任何動物源性物質(zhì)，尤其是牛的病原體和蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細胞治療的體外細胞培養(yǎng)過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。

【其它相關(guān)試劑】

DC-CIK 細胞的制備方法