高效減少組織自發(fā)熒光?——提高免疫熒光分析中的信噪比??

免疫熒光技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的常用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該方法靈敏度高，可使用熒光顯微鏡對組織樣本進(jìn)行分析。該技術(shù)利用熒光分子標(biāo)記的抗體對與之相結(jié)合的抗原進(jìn)行定位，可對蛋白質(zhì)、聚糖蛋白、小生物分子和非生物分子進(jìn)行清晰的亞細(xì)胞可視化研究。但是，組織中的自發(fā)熒光往往會(huì)嚴(yán)重干擾這一技術(shù)的發(fā)展。如這篇文章所述，目前，已經(jīng)研發(fā)出一項(xiàng)技術(shù)，其可顯著降低組織的自發(fā)熒光，提高染色結(jié)果的信噪比。

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自發(fā)熒光是指在免疫熒光檢測過程中產(chǎn)生的與目的信號(hào)無關(guān)的、背景熒光信號(hào)的統(tǒng)稱。組織切片中的紅細(xì)胞（RBCs）和膠原蛋白等成分可產(chǎn)生很強(qiáng)的自發(fā)熒光，其嚴(yán)重影響目的信號(hào)的辨別。此外，組織固定中使用的福爾馬林、多聚甲醛等物質(zhì)也能產(chǎn)生大量的自發(fā)熒光。

組織產(chǎn)生的自發(fā)熒光對組織切片的檢測結(jié)果造成了很大的困擾，尤其對使用綠色和紅色通道熒光的檢測。盡管目前的技術(shù)手段已經(jīng)避免了紅色/遠(yuǎn)紅外波長產(chǎn)生的自發(fā)熒光，但某些情況下，在600-700nm波長范圍內(nèi)仍然可能產(chǎn)生組織的自發(fā)熒光。

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組織自發(fā)熒光產(chǎn)生的原因主要來自于組織本身的組分。主要包括黃素、卟啉、植物葉綠素、膠原蛋白、彈性蛋白、紅細(xì)胞和脂褐素等。這些組分通常在可見光譜的綠色和黃色波長范圍內(nèi)產(chǎn)生熒光。而免疫熒光技術(shù)中最常用的熒光染料是綠色波長通道的熒光素和Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）。組織中這些天然成分發(fā)出的自發(fā)熒光顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的信噪比。

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除去組織切片自身的原因，組織固定中經(jīng)常使用的甲醛、戊二醛和福爾馬林等也會(huì)造成組織的自發(fā)熒光。由于固定劑本身造成的高背景熒光，許多使用福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的組織樣品，尤其是腎臟/脾臟的組織樣本，非常不適用于免疫熒光檢測。這是由于福爾馬林可在藍(lán)色、綠色和紅色波長光譜范圍上產(chǎn)生大量的自發(fā)熒光。

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目前，關(guān)于由組織固定導(dǎo)致自發(fā)熒光顯著增加的機(jī)理尚不清楚。甲醛和戊二醛均可通過形成共價(jià)交聯(lián)來穩(wěn)定組織結(jié)構(gòu)。由于與醛反應(yīng)的蛋白側(cè)鏈種類繁多，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、可逆性以及交聯(lián)劑復(fù)雜的化學(xué)性質(zhì)使得產(chǎn)生交聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)各異。這可能也是導(dǎo)致自發(fā)熒光機(jī)理尚不明確的主要原因之一。

確定減少自發(fā)熒光的技術(shù)方法

FFPE組織中產(chǎn)生的自發(fā)熒光很可能是由于C = C鍵或C = N鍵的存在。為了解決這一問題，有些研究，利用硼氫化鈉來還原C = C和C = N鍵以減少組織的自發(fā)熒光。然而，硼氫化物和與之類似的還原劑在中性pH環(huán)境下很不穩(wěn)定。研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管硼氫化鈉可成功的減少組織中的一些自發(fā)熒光，但該方法的可重現(xiàn)性低、試劑處理難度很大。

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用于減少組織自發(fā)熒光的另外一種方法是光漂白。使用該方法時(shí)，組織切片長時(shí)間暴露于高強(qiáng)度UV輻射下，組織中的成分發(fā)生不可逆的光氧化作用。有研究證明，光漂白與其他處理結(jié)合使用可有效的降低自發(fā)熒光。但該方法耗時(shí)太長。另外，大多數(shù)免疫組化實(shí)驗(yàn)室均缺乏光漂白方法所需的儀器設(shè)備。

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歷史上，用于降低組織自發(fā)熒光的主要方法是用蘇丹黑或類似的非熒光重氮染料溶液處理組織。這些疏水染料可與組織切片進(jìn)行非特異性結(jié)合，結(jié)合后的染料（蘇丹黑）通過吸收入射光來降低組織的自發(fā)熒光（暗淬滅）。

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具體來說，蘇丹黑對降低組織中由脂褐素引起的自發(fā)熒光非常有效。脂褐素是一種很明亮的熒光色素，在一些組織中隨著年齡的增長而積累。脂褐素顆粒由溶酶體消化的脂質(zhì)殘基組成。由于蘇丹黑的疏水特性，其能有效地結(jié)合富含脂質(zhì)的脂褐素顆粒并掩蓋其產(chǎn)生的自發(fā)熒光。但是，蘇丹黑對醛固定、結(jié)締組織和紅細(xì)胞產(chǎn)生的自發(fā)熒光效果較差。

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新技術(shù)

目前，一種減少組織切片自發(fā)熒光的新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)運(yùn)而生。該方法可顯著減少由于福爾馬林固定、膠原蛋白、彈性蛋白和紅細(xì)胞導(dǎo)致的自發(fā)熒光。這項(xiàng)新技術(shù)以Vector^??True VIEW? Auto fluorescence Quenching?Kit形式銷售。該技術(shù)使用親水性的水溶液處理組織切片，可靜電結(jié)合膠原蛋白、彈性蛋白和紅細(xì)胞。此外，這種無熒光、帶負(fù)電的水溶性分子也能有效地結(jié)合組織中的福爾馬林，包括結(jié)腸、胰腺組織、前列腺、扁桃體、脾臟、腎臟、膽囊和胸腺等組織。

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一旦結(jié)合，TrueView淬滅劑便可顯著降低組織中的自發(fā)熒光。這種試劑很可能通過靜態(tài)和暗淬滅機(jī)制相結(jié)合的方式來降低組織中的自發(fā)熒光。

由于TrueVIEW Quencher的親水性特征，組織切片的處理也是在水溶性緩沖液中進(jìn)行的，因此并不需要70％乙醇預(yù)處理步驟。 此外，在免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，只需使用TrueVIEW Quencher處理兩分鐘即可。更重要的是，TrueVIEW淬滅劑可與常見的大部分熒光基團(tuán)兼容，例如熒光素、Alexa熒光劑、DyLight熒光劑、Cyanine熒光劑以及綠色熒光蛋白等。

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TrueView Quencher處理方法的實(shí)用性已在脾臟組織（Fig1A和1B）和胰腺組織（圖1C和1D） 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到證實(shí)。未經(jīng)處理的脾臟組織，在綠色通道中發(fā)生了很強(qiáng)的自發(fā)熒光，這些自發(fā)熒光嚴(yán)重干擾了Ki67的信號(hào)（圖1A）。經(jīng)TrueView Quencher處理后，在黑色背景中，可清晰看到Ki67的亮綠色的目的信號(hào)（圖1B）。此外，圖1還證明了使用TrueView Quencher處理胰腺組織的有效性：經(jīng)處理后，組織中綠色和紅色波長處的自發(fā)背景熒光大大降低（圖1C和1D）。 圖2證實(shí)了TureView Quencher可降低腎組織中綠色和紅色自發(fā)背景熒光，并可保證其正常的DAPI（藍(lán)色通道）核染色。

?圖1.?顯著降低的自發(fā)熒光可揭示靶抗原的真正定位。上圖A、B為人脾臟(FFPE)組織染色結(jié)果: 使用anti-Ki67（綠色）和anti-CD20(紅色)。 (A)未經(jīng)任何處理；（B）經(jīng)TrueVIEW處理；上圖C、D為人胰腺組織染色結(jié)果：使用anti-Insulin（綠色）和anti-END(紅色)。（C）未經(jīng)任何處理；（D）經(jīng)TrueVIEW處理。

圖2.減少綠色和紅色通道的自發(fā)熒光。使用DAPI對經(jīng)抗原修復(fù)的人腎臟組織（FFPE組織）進(jìn)行核染色。綠/藍(lán)通道：（A）未經(jīng)任何處理，（B）經(jīng)TrueVIEW處理。 紅/藍(lán)色通道:（C）未經(jīng)任何處理，（D）經(jīng)TrueVIEW處理。

目前，針對可以降低組織自發(fā)熒光產(chǎn)品的擔(dān)憂主要是使用其處理組織后對目的信號(hào)（通常是熒光基團(tuán)連接的二抗）產(chǎn)生的影響。理想情況下，可以達(dá)到降低組織中的自發(fā)熒光而不影響二抗熒光信號(hào)的目的。

使用TrueVIEW Quencher處理組織后，自發(fā)背景熒光顯著減少。同時(shí)也會(huì)對其二抗熒光造成一定的損失?？赏ㄟ^使用更高濃度抗體（圖3）或延長曝光時(shí)間來彌補(bǔ)這一影響。綜合考慮，在大多數(shù)免疫熒光檢測中，使用Vector True?VIEW Autofluorescence Quenching試劑可顯著提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的信噪比。

圖3.抗原修復(fù)的人腎臟（FFPE組織）染色結(jié)果：使用anti-AE1 / AE3（綠色）標(biāo)記。（A）未經(jīng)處理?（B）經(jīng)TrueVIEW處理。 一抗?jié)舛仍龃?倍可實(shí)現(xiàn)最佳的信噪比（圖B）。A圖中的箭頭部位代表B圖中去除的自發(fā)背景熒光。

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總結(jié)

在發(fā)展擴(kuò)大的免疫熒光技術(shù)領(lǐng)域，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出一種新穎的方法，該方法操作快速、簡單實(shí)用，并可用于具體嚴(yán)重自發(fā)熒光的FFPE標(biāo)本。該方法在基于組織的免疫熒光檢測中具有廣泛的應(yīng)用，并可與標(biāo)準(zhǔn)熒光和共聚焦激光顯微鏡的激光相兼容。注意：該試劑對脂褐素造成的自發(fā)熒光無效。Vector^??True VIEW? Auto fluorescence Quenching?Kit產(chǎn)品詳情請聯(lián)系Vector中國區(qū)獨(dú)家授權(quán)代理商——欣博盛生物。

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