臨床前研究和早期臨床實驗中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關病毒/慢病毒的理想工具

2023-08-25

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Mirus公司最新推出的適用于臨床前研究和早期臨床實驗中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染試劑TransIT-VirusGEN?SELECT Transfection Reagent面世了，TransIT-VirusGEN?系列轉(zhuǎn)染試劑旨在提高載體DNA轉(zhuǎn)染到懸浮和貼壁HEK293細胞的轉(zhuǎn)染效率，并增加重組腺相關病毒和慢病毒的產(chǎn)量。并可提供BSE TSE Statement 和質(zhì)量控制的相關文件，以簡化輔助材料的資質(zhì)認證過程，節(jié)省時間和成本，確保從研發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)的無縫銜接，成為臨床前研究和早期臨床實驗中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺相關病毒/慢病毒的理想工具。

產(chǎn)品特點：

高效轉(zhuǎn)染DNA，適用于臨床前研究和早期臨床實驗中重組腺相關病毒

和慢病毒的大規(guī)模生產(chǎn)；

質(zhì)控嚴格，包括產(chǎn)品性能、批次重復性、無菌性、內(nèi)毒素及支原體含

量測試；

靈活性好，兼容不同的病毒生產(chǎn)平臺并且允許重復過濾；

無動物源成分，保證全合成制劑成分清晰。

驗證實例：


圖1. TransIT-VirusGEN? Reagent和 VirusGEN? AAV Transfection Kit能產(chǎn)生更高的AAV滴度。 A.在Expi293 Expression Media(Thermo Fisher)中生長的Expi293F細胞(Thermo Fisher)使用TransIT-VirusGEN?轉(zhuǎn)染試劑(1.5:1 reagent-to-DNA ratio (vol:wt), Mirus Bio LLC)，VirusGEN?AAV轉(zhuǎn)染試劑盒(Mirus Bio LLC)，PEIpro (1:1，Polyplus)和FectoVIR?-AAV (1:1, Polyplus)的瞬時轉(zhuǎn) 染來產(chǎn) 生重組 AAV2。AAV2是通過轉(zhuǎn) 染 pAAV-hrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質(zhì) 粒(1:1:1的DNA比例，每瓶2 μg/ml-2 mg，Agilent Technologies)產(chǎn)生的。1L的2×106細胞/ml密度在2.8L 的Thomson shake flask中轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后72小時使用化學裂解收獲AAV2。通過轉(zhuǎn)導HT1080細胞來測定功能性滴度，并在轉(zhuǎn)導后48小時使用Guava?easyCyte 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。用少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液測量AAV功能滴度?；蚪M拷貝通過使用引物和靶向CMV啟動子的探針的ddPCR測定。B. 使用 AAV2 Titration ELISA Kit(Progen)測定總組裝衣殼，通過將基因組拷貝數(shù)除以每種條件下的總組裝衣殼來確定GC/capsid?ratio。誤差線代表duplicate flasks的范圍。	圖2. 在不同的懸浮細胞類型和培養(yǎng)基配方中TransIT-VirusGEN? Reagen和VirusGEN?AAV Transfection Kit在AAV生產(chǎn)中的表現(xiàn)優(yōu)于基于PEI的試劑。(A) Expi293F細胞(ThermoFisher)或(B)病毒生產(chǎn)細胞(ThermoFisher)在轉(zhuǎn)染前適應或生長在Expi293培養(yǎng)基 (Thermofisher)、LV-MAX (Thermofisher)、FreeStyle? F17 (ThermoFisher)或BalanCD HEK293 (Irvine Scientific)培養(yǎng)基。使用TransIT-VirusGEN?轉(zhuǎn)染試劑(2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)(體積 :重量 )， Mirus Bio LLC)，VirusGEN? AAV Transfection Kit(Mirus Bio LLC)的 AAV生產(chǎn) 與 PEIpro (1:1reagent-to-DNA ratio(vol:wt)，Polyplus)和PEI MAX (2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)，Polysciences)進行比較。AAV2是通過轉(zhuǎn)染pAAV-hrGFP、pAAV-RC和pAAV-Helper質(zhì)粒(1:1:1 DNA比例，1.5μg/ml = 3μg/孔，Agilent Technologies)產(chǎn)生的。細胞以200萬細胞/ml的細胞密度轉(zhuǎn)染。收獲的病毒用于轉(zhuǎn)導HT1080細胞，并在轉(zhuǎn)導后48小時使用Guava? easyCyte?5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。用少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液測量AAV功能滴度。誤差線代表重復孔的范圍。
	圖3. TransIT-VirusGEN? Reagent和VirusGEN? LV Transfection Kit在多種慢病毒包裝系統(tǒng)方面優(yōu)于基于PEI的試劑。使用TransIT-VirusGEN?轉(zhuǎn)染試劑 +/-將 VirusGEN? LV Enhancer與 PEIpro (2:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polyplus)和PEI MAX (4:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polysciences)進行比較。慢病毒是通過用兩種不同的LV載體混合物(1μg/ml，2μg/ml)轉(zhuǎn)染在Expi293表達培養(yǎng)基(Thermo Fisher)中生長的Expi293細胞而產(chǎn)生的，包括:(A)第三代載體pALD-LentiEGFP-A轉(zhuǎn)移載體和pALD-VSV-G-A、pALDRev-A、pALD-GagPol-A包裝載體 (3:0.5:0.5:2 DNA比例， Aldevron)或(B)第三代載體 pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP? transfer vector(MilliporeSigma) 和 ViraSafe? Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev,pCMV-VSV-G, pCgpV, CellBio Labs) 以 3:0.5:0.5:2 DNA比例轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后18小時，將VirusGEN? LV Enhancer加入到TransIT-VirusGEN?中。含病毒的上清液用于轉(zhuǎn)導293T/17細胞，并在轉(zhuǎn)導后72小時使用Guava?easyCyte? 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。慢病毒功能滴度是從含有少于20%GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差線代表重復孔的范圍。

圖4. TransIT-VirusGEN? Reagent和VirusGEN? LV Transfection Kit可與多種細胞系和培養(yǎng)基配方兼容，用于在懸浮293細胞中生產(chǎn)慢病毒。在LV-MAX生產(chǎn)培養(yǎng)基(ThermoFisher)中生長的病毒生產(chǎn)細胞(293-VP)、在Expi293表達培養(yǎng)基(ThermoFisher)中生長的Expi293細胞或在FreeStyle?F17 (ThermoFisher)中生長的FreeStyle? 293-F細胞在轉(zhuǎn)染前以4×10^6細胞/ml接種(2ml/未處理的6孔板 )。使用 TransIT-VirusGEN 轉(zhuǎn) 染試劑 +/- VirusGEN LV Enhancer(Mirus Bio，3:1 reagent-to-DNA ratio(wt:vol))生產(chǎn)慢病毒。通過以3:0.5:0.5:2的DNA比例(Aldevron，25μg/瓶(1μg/ml最終濃度 ))轉(zhuǎn)染第三代載體 ALD-LentiEGFP-A轉(zhuǎn)移載體和 pALD-VSV-G-A、pALD-RevA、pALD-GagPol-A包裝載體來生產(chǎn)慢病毒。轉(zhuǎn)染后18小時加入 VirusGEN? LV Enhancer。在轉(zhuǎn)導 293T/17細胞后，測量含病毒上清液的功能滴度，并在轉(zhuǎn)導后72小時，使用Guava easyCyte?5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。慢病毒功能滴度是從含有少于 20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差條代表三個孔的標準偏差。	圖5. TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑可以多次過濾且對試劑性能沒有影響。 (A)使用在FreeStyle? F17培養(yǎng)基中生長的懸浮FreeStyle? 293-F細胞生產(chǎn)慢病毒，并用第三代載體pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP轉(zhuǎn)移載體(Sigma)和ViraSafe? Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, Cell Bio Labs)以 3:0.5:0.5:2的DNA比例轉(zhuǎn)染，總質(zhì)粒1ug/ml，使用TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑(3:1，體積:重量)，TransIT-VirusGEN? Transfection Reagent (3:1, vol:wt)通過 0.22 um polyethersulfone(PES)過濾裝置(Millipore Sigma)過濾指定次數(shù)。使用通過含病毒的上清液轉(zhuǎn)導 ? 293T/17細胞，并在轉(zhuǎn)導后72小時使用Guava easyCyte? 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。 (B)AAV2是通過在FreeStyle? F17培養(yǎng)基中生長的懸浮FreeStyle? 293-F細胞產(chǎn)生的，使用TransIT-VirusGEN? Transfection Reagent (2:1, vol:wt)轉(zhuǎn) 染 pAAVhrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質(zhì) 粒 (1:1:1DNA ratio，1.5u g/ml，AgilentT ? echnologies)。收獲的病毒用于轉(zhuǎn)導HT1080細胞，并在轉(zhuǎn)導后48小時使用Guava easyCyte? 5HT Flow Cytometer.流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。對于慢病毒和AAV病毒，功能滴度都是從含有少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差條代表三個孔的標準偏差。

驗證實例

用途	科研		臨床前和早期臨床實驗	后期臨床試驗和商業(yè)生產(chǎn)
名稱	TransIT-VirusGEN?		TransIT-VirusGEN? SELECT	TransIT-VirusGEN? GMP
成分	相同的TransIT-VirusGEN? 試劑配方可隨時使用，化學成分明確，不含動物源，含有77.5%乙醇
是否提供 LV 和 AAV Enhancer Kits	提供		即將推出	提供
	貨號	名稱		貨號	名稱
	MIR 6750	VirusGEN? AAV Transfection Kit		MIR 6815-GMP	VirusGEN? GMP AAV Transfection Kit
	MIR 6760	VirusGEN? LV Transfection Kit		MIR 6825-GMP	VirusGEN? GMP LV Transfection Kit
質(zhì)檢標準	Functional AAV titer assay		Functional AAV titer assay Formulation Identity Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63>	Validated Formulation Identity Assay Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63>
貨號與規(guī)格	MIR 6703 MIR 6704 MIR 6700 MIR 6705 MIR 6706 MIR 6720	0.3 ml vial 0.75 ml vial 1.5 ml vial 5 x 1.5 ml vials 10 x 1.5 ml vials 30ml?	MIR 6730?? MIR 6735 30ml bottle (for 10 L of cell culture) 150ml bottle (for 50 L of cell culture)	MIR 6845-GMP	150 ml bottle (for 50 L of cell culture)
提供文件材料	Certificate of Analysis Certificate of Origin		Certificate of Analysis Certificate of Origin TSE/BSE Statement	Certificate of Analysis Certificate of Origin with TSE/BSE Statement DMF Available in 2022 with Quality Agreement