E. Collagen
膠原
因為去糖基化的膠原會影響關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生（11），同時一些未去除的雜質(zhì)比如：胃蛋白酶可能會導(dǎo)致T 細胞刺激試驗中產(chǎn)生假陽性（12），因此二型膠原應(yīng)按規(guī)定高度純化。如果按恰當(dāng)?shù)姆椒▋龈傻哪z原-20℃避光保存的條件下，是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M 濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/ml，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液可在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。
Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別二型膠原. 比如，DBA/1小鼠對雞或者牛的二型膠原蛋白有較強的免疫反應(yīng)，然后C57B/6 小鼠只對雞的二型膠原蛋白有免疫反應(yīng)。
| Catalog # | Description |
| 20011 | Chick type II collagen,10mg 雞II 型膠原蛋白 |
| 20012 | Chick type II collagen, 5 ml x 2 mg/ml 雞II 型膠原蛋白 |
| 20021 | Bovine type II collagen, 10 mg 牛II 型膠原蛋白 |
| 20022 | Bovine type II collagen, 5 ml x 2 mg/ml 牛II 型膠原蛋白 |
| 20031 | Porcine type II collagen, 10mg 豬II 型膠原蛋白 |
| 20032 | Porcine type II collagen, 5 ml x 2 mg/ml 豬II 型膠原蛋白 |
A. Preparing the Emulsion
乳劑單位制備
乳劑的質(zhì)量對于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎至關(guān)重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦雙注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導(dǎo)致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，超聲處理方法，至少將膠原分成 2 個片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。
推薦使用電動的高速攪拌器：
1.用高速攪拌器 (圖一)（帶直徑≤5mm 的刀片，圖二a）攪拌完全佐劑CFA (或用于增強劑注射的不完全佐劑（IFA）)和膠原溶液 將注射器尖端用三通閥封閉 (圖二b)。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上，并冰浴 (圖三)。最后一步很重要，因在攪拌過程中會發(fā)熱，會引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）。
(圖一 高速攪拌器)
（圖二 (a) 攪拌器刀片-直徑0.5cm, (b)帶三通閥的注射器，（c）玻璃注射器）
（圖三 帶三通閥的注射器固定在支架上，冰?。?/p>
2.加 1 體積（最多不超過注射器的25%）完全佐劑（不完全佐劑在加強免疫時用到）到注射器，再緩慢加入等體積的膠原溶液（0.05M 醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度為 2mg/ml），邊低速攪拌（1000-3000rpm）邊滴入膠原溶液。
注：為保證高質(zhì)量的免疫乳劑，一次量乳劑體積應(yīng)不得超過注射器體積的50%。如果需要多量生產(chǎn)，可重復(fù)以上步驟。
3.繼續(xù)高速混合（10,000 – 30,000rpm）2分鐘。冷卻5分鐘，再重復(fù)高速混合和冷卻步驟2-3次直到產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液。對于大體積乳劑制作（2-5ml）為了是乳液混合均勻，建議在混勻過程中上下移動攪拌刀片。
4.用針頭替換三通閥，在裝有冰水的燒杯里滴一滴乳劑，檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的，如圖所示（圖四），在水中是成團的，不散開。如果乳劑在水中散開，表明乳劑不穩(wěn)定，再加幾滴佐劑，重新混合再次進行測試。
（Figure 4 - 圖四 完整穩(wěn)定的乳劑漂浮在水面）
5.將乳劑轉(zhuǎn)移到1ml的玻璃注射器 （圖二C）.不建議采用塑料注射器，因為很難做到一個準(zhǔn)確的注射劑量。
注：1.通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個精確的注射劑量。
? ? ? ? 2.建議在乳劑制備好的一小時內(nèi)完成注射。乳劑在使用之前存放在4°C。
B. Injection Site
免疫注射部位
在鼠尾根部皮下注射 0.1ml乳劑(100μg膠原每只老鼠（圖五）。例如：從尾根部 2cm 處插入針頭（25號或者27號針頭，長度5/8英尺，針插入皮下，針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。每次注射前充分擦拭針頭，防止乳液的露出。
如果要加強免疫，注射部位在尾根部 3cm 處，針尖插入皮下距鼠尾根部1.5cm處。加強免疫的注射部位應(yīng)避開初始注射部位）。
注: Chondrex公司不建議使用背部皮下注射注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，因為乳劑會引起腹腔和胸腔嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
（圖五 皮下注射乳劑）
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