被廣泛使用的傳統(tǒng)ChIP-seq與新技術(shù)CUT&RUN和CUT&Tag，如何決定哪種染色質(zhì)分析法更適合您的實驗?zāi)?？在這里，我們將根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗幫您確定最佳檢測方法。

關(guān)鍵點1：為何要告別ChIP-seq？

● 樣本要上百萬個細(xì)胞——不適用于珍貴細(xì)胞類型或臨床樣本

●?繁瑣的操作步驟——需要交聯(lián)、染色質(zhì)片段化和免疫沉淀(IP)，實驗周期約為一周

●?高測序深度——通常需要每個庫2,000 - 4,000萬個讀段才能在背景上獲得足夠的信號

●?數(shù)據(jù)結(jié)果不精準(zhǔn)?——背景高，實驗重復(fù)性差和有非特異性的peak

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盡管存在以上短板，ChIP-seq仍然是幾十年來應(yīng)用最廣泛的DNA-蛋白互作技術(shù)。然而，新方法、新技術(shù)往往給科學(xué)研究帶來天翻地覆的變化，CUTANA??CUT&RUN和CUT&Tag的出現(xiàn)解決了ChIP-Seq實驗需要大量細(xì)胞，且重復(fù)性差、低信號、高背景等缺點，為研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用提供了新的有效工具。

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Figure 1: ChIP-seq與CUT&RUN和CUT&Tag的比較

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與ChIP-seq相比，CUT&Tag和CUT&RUN具有許多優(yōu)點。這兩種檢測方法都不需要交聯(lián)、染色質(zhì)片段化或免疫沉淀，即可提供低背景、高可靠性的實驗結(jié)果。同時CUT&RUN和CUT&Tag的實驗周期更短，所需樣本細(xì)胞更少，測序深度更低。

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常見問題?

科學(xué)方法在不斷發(fā)展，在表觀基因組學(xué)領(lǐng)域尤其如此，在過去的十年中，表觀基因組學(xué)經(jīng)歷了快速的技術(shù)增長和擴張。盡管CUTANA?檢測具有明顯的優(yōu)勢，但許多研究人員對從ChIP-seq轉(zhuǎn)換到CUTANA?仍很猶豫。在這里，我們羅列出可能會在ChIP-seq過渡到CUTANA??CUT&RUN分析時常見的一些問題。

Q：我正在研究一種瞬態(tài)相互作用蛋白質(zhì)，需要通過交聯(lián)來穩(wěn)定染色質(zhì)上的目標(biāo)定位。我最好的選擇不是ChIP-seq嗎?

A: CUT&RUN可以生成背景干凈的實驗數(shù)據(jù)，免受高度交聯(lián)相關(guān)的可變IP效率的干擾。如果需要，CUTANA檢測可與輕到中度交聯(lián)條件兼容(Fig. 2)。然而，ChIP-seq所需的高度固定方式不能應(yīng)用于CUT&RUN(或CUT&Tag)。?

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Figure 2:?CUT&RUN在樣品處理過程中保留了全基因組富集。熱圖中使用新鮮、冷凍或交聯(lián)的K562細(xì)胞和新鮮細(xì)胞核，顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的CUT&RUN H3K4me3信號，紅色表示H3K4me3高富集。

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Q：我正試圖將我的結(jié)果與已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)進行比較——我需要繼續(xù)做ChIP-seq嗎?

A：雖然ChIP-seq和CUT&RUN是不同的操作步驟，但原始測序數(shù)據(jù)是相似的，并且使用相同的工具進行處理和可視化。在已有的文獻中多次發(fā)表過這兩種方法的數(shù)據(jù)比對。主要的區(qū)別是CUT&RUN數(shù)據(jù)的背景要低得多，所需的細(xì)胞和測序讀段也比ChIP-seq少了10倍。

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Q：我已經(jīng)有了一個很好的ChIP-seq操作方案或有效的抗體，是否應(yīng)該堅持用下去?

A：與CUT&RUN相比，即使是優(yōu)化后的ChIP-seq，也需要更多的時間、細(xì)胞和測序深度。此外，ChIP-seq本身存在低通量、高背景和成本較高的問題，CUTANA? CUT&RUN完美的解決了這些問題。與ChIP-seq需要交聯(lián)、片段化和IP等條件相比，CUT&RUN對大多數(shù)目標(biāo)蛋白和細(xì)胞類型的優(yōu)化需求更低。

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Q：由于抗體在ChIP中效果很好，不想換掉ChIP-seq。

A：抗體性能并不是選擇ChIP-seq的一個很好的理由。ChIP級別抗體并不可靠，尤其是組蛋白PTMs。EpiCypher發(fā)現(xiàn)超過70%的組蛋白賴氨酸甲基化和?；疨TMs抗體顯示明顯的交叉反應(yīng)性和目標(biāo)蛋白結(jié)合效率低的問題。這包括有較高引用率的H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3抗體。非組蛋白PTM靶標(biāo)，如轉(zhuǎn)錄因子，也面臨著類似的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵點2：CUT&RUN——“萬能”染色質(zhì)分析工具

CUT&RUN是大多數(shù)表觀基因組實驗的理想工具。它為細(xì)胞樣本、目標(biāo)蛋白兼容性和測序成本之間提供了很好的平衡。該技術(shù)操作非常簡單，可根據(jù)具體實驗情況進行優(yōu)化調(diào)整，且隨著EpiCypher開發(fā)的CUTANA? CUT&RUN試劑盒的出現(xiàn)而變得更加容易。

與ChIP-seq相比，CUT&RUN的優(yōu)點如下：

● 針對不同目標(biāo)蛋白的高分辨率數(shù)據(jù)：CUT&RUN與組蛋白PTMs和染色質(zhì)相關(guān)蛋白(包括轉(zhuǎn)錄因子、?表觀遺傳學(xué)的識別、記錄和消除蛋白)兼容，(圖3)。 CUT&RUN還可生成很難使用ChIP-seq進行分析的染色質(zhì)重塑酶圖譜，這也突出了CUT&RUN的另一個關(guān)鍵優(yōu)勢。

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Figure 3:?CUTANA??CUT&RUN分析每次反應(yīng)僅使用300 - 800萬測序讀段，為不同的目標(biāo)蛋白生成高分辨率數(shù)據(jù)。*每個實驗都使用CUTANA?CUT&RUN試劑盒和500,000個K562細(xì)胞進行。

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●?需要的細(xì)胞數(shù)量較少：雖然建議使用500,000個以上的細(xì)胞，但CUTANA??CUT&RUN在不改變操作步驟的前提下，可將細(xì)胞數(shù)量降低至5,000個，從而能夠分析不常見的細(xì)胞和較珍貴的樣本。目前，CUT&RUN已被用于分析小鼠和人類原代細(xì)胞、患者來源的異種移植（PDX）、流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。

●?操作步驟簡單：CUTANA??CUT&RUN在3天內(nèi)即可完成從細(xì)胞到文庫的建立。還適用于多道移液器和8聯(lián)排管，提高了分析的重復(fù)性和通量。

●?測序成本降低：只需要300 - 800萬個測序讀段，高通量測序可以檢測更多樣本。

●?減少實驗中需要優(yōu)化的步驟：如上所述，CUT&RUN跳過了ChIP-seq中最具挑戰(zhàn)性的部分(染色質(zhì)片段化等)，只需要較少的優(yōu)化步驟。EpiCypher的CUTANA?CUT&RUN Kit和CUT&RUN Library Prep Kit使這一過程更加簡單。

注：根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗，與CUT&Tag相比，CUT&RUN更容易學(xué)習(xí)和排除故障，特別是在使用EpiCypher的CUT&RUN檢測試劑盒和Library Prep試劑盒時。

關(guān)鍵點3：CUT&Tag——“專業(yè)級別”染色質(zhì)分析工具

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CUT&Tag更適合在染色質(zhì)分析測定方面具有經(jīng)驗的研究人員。如果您是：

●?剛剛開始接觸表觀基因組分析測定

●?經(jīng)常使用ChIP-seq，打算開始嘗試CUTANA染色質(zhì)分析

●?打算嘗試一個新的目標(biāo)蛋白或使用一個新的細(xì)胞類型

●?低豐度目標(biāo)蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子和其他染色質(zhì)相關(guān)蛋白

在這些情況中，EpiCypher建議使用CUT&RUN，它有一個簡單明了的操作步驟，并可為大多數(shù)目標(biāo)蛋白和細(xì)胞類型生成可靠精準(zhǔn)的實驗結(jié)果。

CUT&Tag比CUT&RUN更具挑戰(zhàn)性

許多研究人員想要用CUTANA CUT&Tag進行染色質(zhì)分析實驗，因為該方法跳過了傳統(tǒng)的文庫準(zhǔn)備步驟，只需要10萬個細(xì)胞核即可獲得高質(zhì)量的測序結(jié)果。EpiCypher通過獨家的Direct-to-PCR技術(shù)進一步簡化了CUT&Tag過程，只需要一個管就可完成從細(xì)胞到PCR文庫擴增。

盡管存在以上優(yōu)勢，根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗，CUT&Tag對相關(guān)實驗操作熟悉度有較高的要求。樣品準(zhǔn)備不充分或細(xì)胞核太少，ConA?bead丟失和抗體特異性或效率較低都會影響CUT&Tag的實驗結(jié)果。與CUT&RUN相比，CUT&Tag也會容易出現(xiàn)更高的duplication rates，并可能在開放染色質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)背景信號?；谶@些原因，我們推薦大多數(shù)用戶使用CUT&RUN。

CUT&Tag并不適用于所有目標(biāo)蛋白

EpiCypher推薦使用CUTANA??CUT&Tag來研究組蛋白PTMs(圖4)和選擇轉(zhuǎn)錄因子(即CTCF)在全基因組上的結(jié)合或分布位點。不建議將CUT&Tag用于染色質(zhì)相關(guān)蛋白分析，這些蛋白通常與染色質(zhì)結(jié)合較弱，在高鹽CUT&Tag溶液中剝離。這是該方法的一個主要缺點，也是EpiCypher繼續(xù)建議大多數(shù)用戶使用CUT&RUN的原因之一。

注:在ChIP中，樣品被交聯(lián)以穩(wěn)定染色質(zhì)上的蛋白質(zhì)，因此允許使用高鹽緩沖液。雖然CUT&Tag與輕度到中度交聯(lián)兼容，但這些條件嚴(yán)重降低了收率。相反，EpiCypher建議在CUT&RUN中使用新鮮細(xì)胞樣本。

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Figure 4:?CUTANA??CUT&Tag是分析組蛋白PTMs的理想工具。

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CUT&Tag是低樣本量和特殊應(yīng)用的理想選擇

盡管上面列出了一些注意事項，但值得注意的是CUT&Tag是專門為少量細(xì)胞的染色質(zhì)分析而設(shè)計的，是CUT&RUN的補充技術(shù)。

為什么CUTANA??CUT&Tag是低樣本量應(yīng)用的理想選擇?

●?Tn5 tagmentation消除了傳統(tǒng)的交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、IP和文庫準(zhǔn)備步驟，減少了操作時間并最大化靶標(biāo)回收率。當(dāng)嘗試用少量或單細(xì)胞進行分析時，精簡的處理步驟是至關(guān)重要的。在CUT&Tag中，pAG-Tn5準(zhǔn)確導(dǎo)向結(jié)合區(qū)域并進行DNA切割，省去了ChIP-seq中最耗時的步驟。

●?EpiCypher獨家的Direct-to-PCR CUT&Tag技術(shù)允許您在一個管中完成從細(xì)胞到PCR文庫的擴增。而每次細(xì)胞/DNA被洗滌，轉(zhuǎn)移到新的試管中，或在進行純化時，都會面臨丟失樣本的風(fēng)險。Direct-to-PCR CUT&Tag只需要一個DNA純化步驟，可以在短短兩天內(nèi)完成。

●?CUTANA CUT&Tag操作中首選100,000個核，但對于一些選定的目標(biāo)，可低至1,000個核(圖5)。由于CUTANA CUT&RUN分析驗證過的最少是5,000個細(xì)胞，因此CUT&Tag為研究人員突破表觀基因組學(xué)的檢測界限提供了解決方法。

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Figure 5:?CUT&Tag僅使用1000個細(xì)胞即可生成低豐度(H3K4me3)和高豐度(H3K27me3)組蛋白PTMs的高質(zhì)量圖譜。

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選擇適合您的染色質(zhì)分析測定方法?

下面是一個快速檢查表，可以幫助您為您的項目選擇最佳的檢測方法:

（一）推薦使用CUT&RUN作為首選的染色質(zhì)分析檢測方法，適用于多種目標(biāo)蛋白、細(xì)胞類型和細(xì)胞處理條件。如果每次反應(yīng)可以有5,000到500,000個細(xì)胞，并且滿足以下條件，CUT&RUN為最優(yōu)選擇：

1．剛開始接觸染色質(zhì)分析或CUTANA?技術(shù)

2．新的目標(biāo)蛋白或使用新的細(xì)胞類型

（二）CUT&Tag是創(chuàng)新型應(yīng)用于極少量細(xì)胞樣本的分析方法。適合于有經(jīng)驗的研究人員。

1．CUT&Tag適用于組蛋白PTMs分析

2．CUT&Tag實驗條件通常需要比CUT&RUN更多的摸索及優(yōu)化

3．CUT&Tag每次反應(yīng)需要1,000至100,000個細(xì)胞

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