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抗體五大支柱驗證

2022-11-10
瀏覽次數(shù): 227

GeneTex 是由科學家為科學研究而創(chuàng)立,我們了解研究人員期望并要求產(chǎn)品保真度,考慮到這一點,我們將越來越多的敲除/敲弱 (KO/KD) 驗證測試納入我們的質(zhì)量保證 (QA) 標準,KO/KD 測試是我們提升“五大支柱驗證”計劃的主要方式,目的是向我們的客戶證明他們購買的 GeneTex 試劑值得他們信賴。


在特異性和性能可變性方面,人們越來越不信任市售抗體,因此,科研界要求抗體供應商加大力度,更徹底地驗證他們的產(chǎn)品,解決此問題的一種方法是通過敲除或敲弱靶蛋白。


GeneTex通過利用 CRISPR/Cas9 和 shRNA 生成的細胞裂解物進行蛋白質(zhì)印跡分析,繼續(xù)為科研界提供最高質(zhì)量和最嚴格驗證的抗體,迄今為止,我們已經(jīng)評估了我們的大部分特色產(chǎn)品,并將繼續(xù)在我們的整個抗體目錄中擴大這些努力。


2016 年 Nature 子刊建議的 5 種抗體驗證方式,即是挑選抗體的金標準。


五大驗證包含基因敲除敲弱驗證、比較抗體驗證、免疫捕獲與質(zhì)譜分析、生物特性與正交策略、蛋白過表達策略等驗證方式,說明如下:


一 基因敲除敲弱驗證

抗體五大支柱驗證

利用CRISPR/Cas9或RNAi等技術(shù),將目標基因敲除或敲弱以驗證抗體對蛋白質(zhì)表現(xiàn)量變化的信號反饋。

抗體五大支柱驗證

敲除(Knockout)使用 CRISPR/Cas9 將目標基因從整個基因組里去除,使目標蛋白不表達,收取此 Knockout 細胞裂解液作為對照組,可確認抗體專一性。

抗體五大支柱驗證

敲弱(Knockdown)使用 siRNA 將目標基因靜默,基因還在,但蛋白表達量降低甚至不表達。收取此 Knockdown 細胞裂解液作為對照組,可確認抗體專一性。


基因敲除敲弱驗證就是取有表達蛋白的細胞裂解液,跟使用基因技術(shù)去除或減少蛋白的裂解液做比較,如果抗體專一性辨識蛋白,應該會出現(xiàn)一個樣本有強條帶,另一個樣本弱(無)條帶,如抗體無專一性則條帶無變化。


范例: Vimentin antibody [HL1506] (GTX636980)

抗體五大支柱驗證


二 比較抗體驗證

抗體五大支柱驗證

使用兩種可識別目標蛋白表面不同抗原表位的獨立抗體,并通過對比或定量分析確定特異性。相同靶標、相同處理的樣品,理論上抗體辨識的條帶位置應該相同。如不相同,可能有其一抗體辨識錯誤蛋白或是其他原因;另外也可以通過比較找到更高敏的抗體。


范例: ERK1 (phospho Thr202/Tyr204) + ERK2 (phospho Thr185/Tyr187) antibody [HL173] (GTX635617)

抗體五大支柱驗證


三 免疫捕獲及質(zhì)譜分析

抗體五大支柱驗證

利用IP/MS分析可直接定序與抗體直接發(fā)生相互作用的目標蛋白以及其所形成的蛋白質(zhì)復合物,將免疫捕獲的目標蛋白進行質(zhì)譜分析,可確認捕獲的蛋白身份是否為目標蛋白,以此確認抗體是否辨識到對的蛋白。


范例: PARP antibody [N2C1], Internal (GTX112864)


GTX112864 PARP 抗體通過免疫捕獲及質(zhì)譜分析驗證(PMID:30377371),可進行 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、ChIP assay 等多種應用,GeneTex的“PARP antibody [N2C1], Internal”通過了五項“抗體驗證支柱”的所有測試,證實其具高質(zhì)量,高性價,與高特異性的產(chǎn)品優(yōu)勢。此外,它已在多篇文獻中被引用,在不同物種上均能進行DNA修復,基因組穩(wěn)定性和細胞凋亡方面的研究。

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證


四 生物特性與正交策略

抗體五大支柱驗證

生物特性與正交策略是指利用目標蛋白質(zhì)本身的生物特性作為基礎進行定性與定量驗證,或使用非抗體依賴方法(例如RNA表達量),檢測基于抗體與生物特性或非抗體定量間的相關(guān)性,來驗證抗體的專一性,包含:

1. 使用加藥測試;

2. 以特殊條件處理細胞;

3. 使用已知具有蛋白高低表達量的樣本作為陽性與陰性對照組;

4. 細胞定位;

5. 組織專一性。

6. 范例: PD-L1 antibody [HL1041] (GTX635975)

抗體五大支柱驗證


五 目標蛋白過表達

抗體五大支柱驗證

利用在細胞中過表達目標蛋白,并收取細胞裂解液后進行 WB 分析,理論上蛋白量增多,抗體辨識后的信號也會增強,因此可確認抗體是否特異性辨認正確蛋白,過表達目標蛋白可作為抗體驗證的正控制組。


范例: PAX3 antibody [HL160] (GTX635463)

抗體五大支柱驗證


問題:

Q:五項驗證要同時通過嗎?

A:五項驗證要同時通過是非常困難的,主要受限于技術(shù)與材料,大部分的抗體驗證僅能通過 1~2 項的驗證,能同時通過 5 項驗證可說是少之又少,GeneTex的GTX109669 Calnexin抗體就是少數(shù)的例子之一,該抗體通過 5 項驗證方法,并且全面驗證 WB、ICC/IF、IHC-P、IP,是目前唯一一個能同時通過 5 種驗證的Calnexin抗體。

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證

抗體五大支柱驗證

注:【免疫捕獲及質(zhì)譜分析】驗證數(shù)據(jù)請參考 Nat Methods 期刊(PMID:30377371)


GeneTex還有 GTX628887 EGFR 抗體和GTX629744 Vimentin抗體、GTX107678 NFkB p65抗體、GTX112864、GTX112839 PARP 抗體都是少數(shù)同時通過五種驗證的例子。

貨號

產(chǎn)品名稱

應用

物種

GTX109669

Calnexin antibody [C3], C-term

WB, ICC/IF, IHC-P, IP

Hu, Ms,
Rat, Sheep

GTX628887

EGFR antibody [GT133]

WB, ICC/IF, IHC-P, IP

Hu

GTX629744

Vimentin antibody [GT812]

WB, ICC/IF, IHC-P, IHC-Fr, FACS, IP, ELISA, Sandwich ELISA

Hu, Ms, Rat

GTX107678

NFkB p65 antibody

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, EMSA

Hu, Ms,?Rat

GTX112864

PARP antibody [N2C1], Internal

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, ChIP assay

Hu, Ms,?Rat

GTX112839

PARP antibody [N1N2], N-term

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, ChIP assay

Hu,?Rat


挑選通過基因敲除敲弱、比較抗體、免疫捕獲及質(zhì)譜分析、生物特性與正交策略和蛋白過表達五大支柱驗證的抗體,有助于實驗不走彎路,降低失敗率,更快完成實驗。



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