1. PeproGrow? hESC的配方是什么？

PeproGrowTM hESC培養(yǎng)基是PeproTech與美國羅格斯大學干細胞培訓中心合作研發(fā)的專有配方，不含血清和酚紅，化學成分明確。每個PeproGrow? hESC培養(yǎng)基試劑盒中包含一瓶基礎培養(yǎng)基和一管單獨的PeproTech重組生長因子凍干粉。

2. 如何儲存PeproGrow? hESC培養(yǎng)基？

基礎培養(yǎng)基避光2°C - 8°C最長保存6個月，生長因子凍干粉組分2°C -8°C可保存6個月，-20°C至-80°C則可保存長達5年。

3. PeproGrow? hESC培養(yǎng)基應該如何使用？

生長因子凍干粉在開蓋前需離心，然后根據(jù)試劑盒的規(guī)格不同用100 μl或500 μl細胞培養(yǎng)級無菌水重懸。如果兩周內(nèi)能用完，則將全部的已重懸生長因子組分無菌操作加入基礎培養(yǎng)基中，通過旋轉(zhuǎn)或吹打充分混勻。如果兩周內(nèi)用不完，則需無菌操作取所需體積的基礎培養(yǎng)基至一個無菌的聚碳酸酯(PC)瓶或錐形底聚丙烯(PP)管中，然后按比例加入已重懸的生長因子組分，并通過旋轉(zhuǎn)充分混勻。如果整個過程均為無菌操作，配制完成后無需再次過濾除菌。在瓶子標簽上標注配制時間及新的有效期(混合后2周)，避光保存于2°C - 8°C。細胞換液前，僅取當次所需量的培養(yǎng)基，復溫后使用。

4. 從我目前使用的培養(yǎng)基更換為PeproGrow? hESC培養(yǎng)基時必須進行適應培養(yǎng)嗎？

在兩種均含胰島素的培養(yǎng)基間切換不必進行適應培養(yǎng)，而當從含胰島素的培養(yǎng)基更換為不含胰島素的培養(yǎng)基時則可能需要適應培養(yǎng)。是否需要適應培養(yǎng)液也與細胞類型有關。當快速方案(無適應培養(yǎng))的效果不盡如人意時，額外的適應培養(yǎng)(短期或長期的)可能就有必要了。如果短期的適應培養(yǎng)不奏效時，可使用長期的適應培養(yǎng)，同時逐步提高新培養(yǎng)基的比例，如按100:0，80:20，60:40，20:80和0:100分步進行。請閱讀PeproGrow? hESC培養(yǎng)基使用手冊，以獲取更多信息。

5. 適應培養(yǎng)過程中出現(xiàn)分化正常嗎？

在快速方案和適應培養(yǎng)中出現(xiàn)一些分化都是正常的。您可以刮除分化的克隆，或者挑取未分化的克隆至一個新的包被好的細胞培養(yǎng)皿上繼續(xù)培養(yǎng)。請閱讀PeproGrow? hESC培養(yǎng)基使用手冊，以獲取更多信息。

6. 更換為PeproGrow? hESC培養(yǎng)基后，我的細胞會發(fā)生改變嗎？

盡管無法精確地預估細胞可能發(fā)生的變化，但在使用PeproGrowTM hESC培養(yǎng)基時克隆形態(tài)在可能會發(fā)生一些改變，比如細胞變得扁平等，但未觀察到過細胞多能性和細胞表型的變化。在適應培養(yǎng)過程中，細胞可能會變得更加健壯，更能耐受傳代所帶來的損傷。請閱讀PeproGrowTM hESC培養(yǎng)基使用手冊，以獲取更多信息。如果使用實驗室常規(guī)的方法培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)細胞改變，則無需改變培養(yǎng)方法。

7. 細胞應在包被的還是未包被的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)？

不建議在未包被的塑料器皿中培養(yǎng)細胞。在適應培養(yǎng)的初始階段，推薦用Corning Matrigel?包板，后面可使用其它合適的細胞外基質(zhì)(ECM)。PeproTech為自己的干細胞培養(yǎng)基特制了一款包板試劑，即無動物成分的重組人Vitronectin(玻連蛋白)基質(zhì)和緩沖液試劑盒(產(chǎn)品編號：AF-VMB-220)。該試劑可直接包板使用，也可與細胞預混后加入培養(yǎng)器皿。

8. 酶消化法傳代后，細胞為什么貼壁不好？

原因最有可能是消化過度了。然而，消化后如仍有貼壁的克隆，可繼續(xù)常規(guī)換液。4-6天后，有些細胞會茁壯長出，從其中挑選出2-4個克隆即可將您的培養(yǎng)維持下去。為避免過度消化，您可使用非酶消化法傳代。注意：用無動物成分的重組人Vitronectin基質(zhì)包板時，不能用酶消化法傳代，此時應用僅含有PBS, HEPES和EDTA的等滲細胞傳代/非酶法消化液(產(chǎn)品編號：CPD-125)來傳代。

9. 酶消化傳代后如果細胞貼壁不好，有什么改善的方法嗎？

研究發(fā)現(xiàn)，添加2-10 μM(2 μM最佳)的Y-27632或ROCK抑制劑，可顯著改善酶消化法(使用Dispase(分散酶)或Accutase?)傳代后細胞的存活及貼壁情況。而過量的Y-27632除能引起可逆的形態(tài)學改變外，還可導致神經(jīng)分化。

10. 關于細胞傳代，還有其它建議嗎？

下面是我們的一些建議，您也可以參閱PeproGrow? hESC培養(yǎng)基使用手冊。

確定合適的消化時間是細胞傳代過程中至關重要的一步。使用Dispase酶消化時一定要避免過度消化，因為過度消化會造成克隆不貼壁或貼壁時發(fā)生自身折疊。

培養(yǎng)5-7天后，克隆很可能會長至足夠大，此時可以傳代。

出現(xiàn)一些細胞死亡是正常的。用Dispase酶法傳代后，一定比例的細胞會不貼壁。但如果活細胞比例低于50%，則說明消化過頭了。PBS/EDTA法傳代則更為溫和，正確操作時會有很好的克隆回收率。

11. 對于細胞傳代的時機，你們還有什么建議？

傳代時機很關鍵，如果傳代過早，細胞會因克隆過小而鋪板能力較差，且傳代后不易存活。避免膠原酶的過度消化也極為重要。我們推薦使用Disapase酶或PBS/EDTA法，均是消化5分鐘最佳，但在消化3分鐘時需鏡下觀察細胞狀態(tài)，以確定是否用滿5分鐘。

12. 細胞密度對克隆生長有什么影響？

細胞過疏或過密，均易引起自身分化。如傳代比例過高，細胞將無足夠的自分泌因子來提高其活力，許多細胞會死亡和/或分化，因此我們建議培養(yǎng)皿中的細胞在接近融合時傳代。使用Dispase酶法傳代時，可嘗試1:6、1:12或1:18的傳代比；而用PBS/EDTA法傳代時，則可嘗試1:6、1:12、1:18或1:24的傳代比。如果需要，可進一步提高傳代比。當使用Dispase酶法且細胞接種密度較低時，我們建議在傳代時添加Y27632，如采用PBS/EDTA法，則無需添加。

13. 細胞鋪板時需注意些什么？

我們建議沿著孔的邊緣(僅針對六孔板)接種細胞，并輕輕地來回晃動培養(yǎng)板，使細胞混合均勻。如果使用其它規(guī)格的培養(yǎng)器皿，加細胞時可通過移動槍頭來分散細胞。

14. 對于換液，有什么特別的建議嗎？

每天換液。特殊情況下，可通過一次“雙倍換液”來度過周末。

15. 我能用以上推薦的基質(zhì)以外的基質(zhì)來包被細胞培養(yǎng)器皿嗎？

可以的。我們測試過幾種其它的包板基質(zhì)，包括Laminin/Entactin(BD?)，重組人Vitronectin(PeproTech；產(chǎn)品編號為140-09和AF-140-09)和Synthemax II? (Corning)。在標準的細胞培養(yǎng)塑料器皿上，以Laminin/Entactin作為包被基質(zhì)，細胞生長狀態(tài)可以達到與Corning Matrigel?近乎一致的水平。而以人Vitronectin和Synthemax II?作為包被基質(zhì)時，則推薦使用CellBIND?或其它同等類型的細胞培養(yǎng)塑料器皿，才可達到最佳的包被效果?？寺〉难诱剐院唾N壁能力弱時有發(fā)生，此時需添加Y-27632處理一段時間。

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