ProImmune 的 ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)可用于鑒定引發(fā)輔助 T 細(xì)胞增殖并因此可能引起輔助 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的表位序列。
與基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)測(cè)定不同，該測(cè)定利用強(qiáng)大的流式細(xì)胞術(shù)方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定增殖細(xì)胞的百分比和 T 細(xì)胞反應(yīng)的詳細(xì)表型，所有這些都顯著提高了整體靈敏度。
為什么選擇 ProMap? CFSE 增殖檢測(cè)？
1.CFSE 染料稀釋是一種久經(jīng)考驗(yàn)的方法，已被數(shù)以千計(jì)的出版物引用
2.比放射性分析靈敏得多
3.流式細(xì)胞儀讀數(shù)可解析要分析的正確細(xì)胞群，例如活 CD4+ T 細(xì)胞
4.可以輕松添加進(jìn)一步的子集表型，并且可以同時(shí)讀出子集的增殖
5.積分測(cè)定測(cè)量增殖時(shí)間范圍內(nèi)的所有增殖，而不是孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)的時(shí)間窗口
主要出版物：
使用英國國防部下屬的 [dstl] 發(fā)布的 ProMap? T 細(xì)胞檢測(cè)驗(yàn)證抗體人源化
Figure 1：比較小鼠和抗體人源化 V 區(qū)中重疊的肽 T 細(xì)胞反應(yīng)
O’Brien LM, Goodchild SA, Phillpotts RJ, Perkins SD. Virology (2012) 426(2):100-5.[PMID:22341308]
英國政府國防科技實(shí)驗(yàn)室 [dstl] 的科學(xué)家使用 ProImmune 的 T 細(xì)胞增殖檢測(cè)來驗(yàn)證他們對(duì)抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 (VEEV) 抗體的人源化。序列人源化是一種將抗體中的動(dòng)物蛋白序列替換為人蛋白序列的合理設(shè)計(jì)方法。然而，這種方法并不能保證所得到的生物制劑具有低免疫原性。通過在體外 T 細(xì)胞分析中使用序列掃描，可以生成抗原性數(shù)據(jù)以顯示嵌合序列和人源化序列之間的差異。在此處閱讀完整的案例研究
ProMap? T 細(xì)胞檢測(cè)和肽/蛋白質(zhì)療法
這個(gè) ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)已開發(fā)用于鑒定潛在 T 細(xì)胞表位的存在與否，可用于新肽或蛋白質(zhì)的臨床前發(fā)現(xiàn)。這些檢測(cè)可以解決結(jié)構(gòu)相似分子之間的“相對(duì)免疫原性”問題；例如，它們可以幫助區(qū)分不同的候選物，或者可以指示蛋白質(zhì)工程策略在潛在免疫治療劑的去免疫化方面是否成功。
作為 ProImmune’s REVEAL? 免疫原性系統(tǒng)的一部分，ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)的結(jié)果可以與 50 多個(gè) II 類 HLA 等位基因的無細(xì)胞 HLA 肽結(jié)合測(cè)定的結(jié)果一起分析。這為客戶提供了輔助 T 細(xì)胞對(duì)一種或多種藥物先導(dǎo)物的免疫反應(yīng)的詳細(xì)資料。
Figure 2: ProMap? T 細(xì)胞增殖測(cè)定原理。
20-50 個(gè) HLA 型供體的 PBMC 選自 ProImmune 生物庫
根據(jù)項(xiàng)目要求合成肽庫
供體 PBMC 用 CFSE 染料標(biāo)記
每個(gè)肽都與來自每個(gè)供體的 PBMC 共培養(yǎng)
響應(yīng)肽的 CD4+ T 細(xì)胞增殖導(dǎo)致 CFSE 標(biāo)記稀釋
CFSE 的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合 CD4 染色，用于定量細(xì)胞分裂，并提供抗原性的測(cè)量
ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)的詳細(xì)信息
細(xì)胞用熒光染料 5,6-carboxyflurescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) 標(biāo)記。那些響應(yīng)抗原而增殖的細(xì)胞顯示出 CFSE 熒光強(qiáng)度的降低，這是通過流式細(xì)胞術(shù)直接測(cè)量的。由于這是一種流式細(xì)胞分析，它可以準(zhǔn)確地確定增殖 CD4+ 細(xì)胞的百分比，能夠?qū)?T 細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的表型分析，并且比基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)分析更靈敏。
ProImmune 提供兩種類型的 T 細(xì)胞增殖檢測(cè)：
用于肽表位作圖的 ProMap? T 細(xì)胞檢測(cè)
該測(cè)定用于鑒定可引發(fā)輔助性 CD4+ T 細(xì)胞增殖并因此可能引起輔助性 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽表位序列，從而可能導(dǎo)致抗藥抗體 (ADA) 反應(yīng)或其他不需要的免疫原性。該測(cè)定還可用于評(píng)估蛋白質(zhì)序列的有益免疫原性，例如用于免疫治療的表位發(fā)現(xiàn)。
在該檢測(cè)旨在關(guān)注 CD4+ 輔助 T 細(xì)胞反應(yīng)的情況下，CD8+ T 細(xì)胞耗盡和 CFSE 標(biāo)記的供體 PBMC 與 5uM 的每種目標(biāo)肽在六個(gè)重復(fù)孔中培養(yǎng) 7 天。每個(gè)測(cè)定板包括一組未處理的對(duì)照孔。該檢測(cè)還包括參考抗原對(duì)照，包括已知 MHC II 類抗原的合成肽和兩種有效的全蛋白抗原。
Figure 3. 來自 na?ve T 細(xì)胞測(cè)定的示例染色數(shù)據(jù)，(1) CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞單獨(dú)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)（未刺激），(2) CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞與來自目標(biāo)抗原的肽一起培養(yǎng)，(3) CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞用對(duì)照蛋白（結(jié)核菌素 PPD）培養(yǎng)。
細(xì)胞增殖通過流式細(xì)胞術(shù)分析確定。對(duì)于 ProMap? T 細(xì)胞檢測(cè)，通過與未刺激樣品的結(jié)果進(jìn)行比較，確定每個(gè)刺激樣品的高于背景的刺激百分比。每個(gè)樣本中 CD4+ CFSE 暗淡群體的計(jì)數(shù)表示為總 CD4+ 群體的比例。六個(gè)重復(fù)值用于計(jì)算高于背景的刺激百分比（有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗淡細(xì)胞的比例，減去沒有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗淡細(xì)胞的比例）。
平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差是從六份值計(jì)算出來的。如果高于背景的百分比刺激大于 0.5% 并且高于背景的 2 倍標(biāo)準(zhǔn)誤差，則結(jié)果被認(rèn)為是“陽性”，盡管數(shù)據(jù)也提供了不太嚴(yán)格的閾值以允許考慮小響應(yīng)。
為了比較肽，計(jì)算響應(yīng)指數(shù)。該指數(shù)基于每種肽的反應(yīng)幅度（高于背景的刺激百分比）乘以每種肽的反應(yīng)供體數(shù)量（抗原性百分比）。
報(bào)告中提供的數(shù)據(jù)是：
Figure 4. 使用 ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)測(cè)量的抗原性百分比：一組 43 名供體用于測(cè)試來自兩種治療性單克隆抗體 Remicade 和 Humira 重鏈區(qū)域的肽的潛在免疫原性。每個(gè)供體用不同的顏色表示。引起 2 個(gè)或更多供體反應(yīng)的肽被認(rèn)為值得進(jìn)一步研究。
Figure 5. ProMap? T 細(xì)胞增殖檢測(cè)的反應(yīng)指數(shù)：來自與圖 3 相同檢測(cè)的數(shù)據(jù) – 反應(yīng)指數(shù)表明對(duì)測(cè)試肽的反應(yīng)的幅度和數(shù)量。請(qǐng)注意，PPD 的響應(yīng)不在此圖的范圍內(nèi)。