| WB?實(shí)驗(yàn)結(jié)果有黑點(diǎn) |
| 原因 | 解決方案 |
| 封閉液未溶解完全 | a.?確認(rèn)奶粉完全溶解。出現(xiàn)黑點(diǎn)最常發(fā)生的原因是奶粉沒有完全溶解，建議加入攪拌子，增加攪拌時(shí)間，或是溶解后離心取上清液使用。
b.?利用0.45 um的濾紙過濾溶液，以除去未溶解的牛奶顆粒及其他雜質(zhì)。
c.?改變封閉液的種類，如換為BSA。 |
| 溶液污染 | a.?使用新鮮配制的溶液?（跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗脫等緩沖液）或商業(yè)化溶液，以減少因長菌長霉造成的黑點(diǎn)。
b.?確認(rèn)一抗溶液是否保存不當(dāng)，可嘗試重新配置一抗溶液。 |
| 封閉液及抗體交互作用 | 一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會(huì)與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合，因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時(shí)洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點(diǎn)或高背景值狀況。
注：a.?TBST是以Tris為基底，PBST是以磷酸鹽為基底的緩沖液，一般根據(jù)習(xí)慣選擇使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗體或最終顯色分析是用AP系統(tǒng)時(shí)，因?yàn)镻BST中的磷酸根會(huì)干擾，可能會(huì)造成高背景值或無信號(hào)，此時(shí)建議使用TBST緩沖液。另外，同一次實(shí)驗(yàn)中請(qǐng)使用一種緩沖液，不可封閉液用PBST，洗脫液用TBST。
b.?封閉時(shí)一般使用3-5%封閉溶液，依實(shí)驗(yàn)特性不同，可做微調(diào)；牛奶與BSA的選擇也是相同，掌握原則后，再依實(shí)驗(yàn)特性做微調(diào)，就能快速上手。 |
| WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果信號(hào)過曝 |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白樣品過量 | 降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50 ug，但有些蛋白的表達(dá)量較高（如beta actin），此時(shí)可依蛋白表現(xiàn)量，調(diào)整上樣量。 |
| 抗體過量 | a.?提高抗體稀釋倍數(shù)。產(chǎn)生過曝時(shí)可提高一抗、二抗的稀釋倍數(shù)。
b.?減少孵育時(shí)間
c.?于4℃孵育 |
| 信號(hào)過曝 | a.?縮短曝光時(shí)間。過曝時(shí)可縮短曝光時(shí)間，減少過曝的情形。
b.?使用低靈敏度的化學(xué)發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象也有可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過強(qiáng)導(dǎo)致的,?可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來改善。
注：化學(xué)發(fā)光底物一般有三種等級(jí)，femto（飛克, 10-15g），?pico（皮克, 10-12g）,?及plus（低皮克級(jí), 10-12~ 10-9g），可依蛋白表達(dá)量挑選適合的化學(xué)發(fā)光底物。 |
| WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果拖帶 |
| 原因 | 解決方案 |
| 樣本不純，有雜質(zhì)污染 | a.?重新離心樣品后取上清液使用
b.?使用較純的試劑配置細(xì)胞裂解液或購買商業(yè)化產(chǎn)品
c.?使用Benzonase?核酸酶。Benzonase?核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對(duì)跑膠的干擾
d.?全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取。使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。 |
| 蛋白樣品過量 | a.?降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。
b.?延長加熱時(shí)間。蛋白變性不完全,?也會(huì)使條帶成團(tuán)拖尾，此時(shí)可通過延長樣品加熱時(shí)間（一般約5分鐘）及調(diào)整SDS（一般是2 %）比例,?使蛋白變性更完全。 |
| 信號(hào)過曝 | a.?縮短曝光時(shí)間。過曝時(shí)可縮短曝光時(shí)間,?減少過曝的情形。 |
| b.?使用低靈敏的化學(xué)發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過強(qiáng)導(dǎo)致的,?可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來改善。 |
| WB條帶扭曲 |
| 原因 | 解決方案 |
| 膠沒配置好 | a.?確保APS & TEMED?正常,?并新鮮配置膠體。
APS為起始劑，主要負(fù)責(zé)提供自由基供膠體進(jìn)行聚合反應(yīng)，?APS粉末容易受潮，建議置于防潮箱保存，如果發(fā)生結(jié)塊，建議重新購買。TEMED為催化劑，如果保存不當(dāng)或過期，也會(huì)影響膠體聚合，建議分裝。
b.?小心移除齒梳，避免造成加樣壁孔歪斜
c.?配完下層膠后，需用水或醇類將膠體壓平
d.?膠里面有雜質(zhì)/氣泡。可預(yù)先用0.45 um濾紙過濾膠體溶液，混合膠體溶液時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 |
| 電流電壓問題 | a.?避免用高電壓電泳使膠體過熱。?150V，過熱有霧氣，80-100V，上膠帶短、下層不勻。
b.?空的孔道加樣品緩沖液，使每個(gè)孔洞都有樣品且鹽類成分相近。
c.?避免孔洞中有雜質(zhì)，用高純度等級(jí)的化學(xué)藥品或用商業(yè)化試劑提取蛋白樣品，或在上樣前用跑膠緩沖溶液沖洗加樣孔。 |
| 轉(zhuǎn)膜問題 | a.?膠體應(yīng)與膜密合，轉(zhuǎn)膜時(shí)小心滾壓膠體，使膠體與膜貼合緊實(shí)
b.?轉(zhuǎn)膜時(shí)小心勿晃動(dòng)。有時(shí)出現(xiàn)?2個(gè)條帶是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時(shí)發(fā)生晃動(dòng)，產(chǎn)生疊影
條帶呈啞鈴狀
出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配置好，膠凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以試著注意膠體是否凝固完全（確認(rèn)試劑沒問題），拔梳子時(shí)注意不要讓孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer沖洗孔道，另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來，或沒有溶解，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。 |
| 條帶呈啞鈴狀 | 原因：出現(xiàn)啞鈴狀最可能是膠沒有配制好，膠凝固后不均，拔完齒梳之后，某些孔道凸起不平整，另一種可能是樣品中含有過多雜質(zhì)，沒有離心下來，或沒有溶解，導(dǎo)致雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。
解決方案：確認(rèn)膠體是否凝固完全，拔齒梳時(shí)注意不要讓孔道歪斜，上樣前可再用跑膠緩沖液沖洗孔道。 |
| WB背景值較高 |
| 原因 | 解決方案 |
| 封閉不足 | a.?提高封閉液濃度，確保封閉液完全覆蓋轉(zhuǎn)印膜，如使用5%?脫脂奶粉或BSA。
b.?增加封閉時(shí)間，一般情況會(huì)使用37℃封閉1小時(shí)，可視情況調(diào)整封閉的條件。
c.?使用BSA作為封閉液，同時(shí)搭配使用TBST的洗脫液來降低高背景值的狀況。 |
| 抗體問題 | a.?抗體濃度太高。建議降低抗體濃度，并增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。
b.?一抗孵育溫度過高，建議4℃孵育過夜。
c.?二抗的非特異性背景，可增加二抗對(duì)照，以陽性對(duì)照組確認(rèn)二抗。
d.?洗脫不足，增加洗脫液體積和洗滌次數(shù)。 |
| 顯色問題 | 化學(xué)發(fā)光底物過多，建議調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物，按說明書加入適量的顯色底物。也可依據(jù)蛋白表達(dá)量的不同，選擇合適的化學(xué)放光底物。 |
| 膜的問題 | a.?挑選合適的NC或PVDF膜。依據(jù)靶標(biāo)蛋白、想要呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及膜的特性，選擇出適合實(shí)驗(yàn)的材料。
b.?建議實(shí)驗(yàn)過程中都必須注意讓膜保持濕潤，特別是PVDF膜。
c.?在使用PVDF膜時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)浸潤不均勻的情況，從而導(dǎo)致背景值比較高的情況。因此，建議使用PVDF膜前使用100% methanol完全浸潤膜。 |
| WB條帶非專一性 |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白質(zhì)降解 | a.?蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑
b.?冰上操作
c.?避免反復(fù)凍融 |
| 蛋白質(zhì)形成多聚糖 | a.?使用現(xiàn)配的DTT/2-ME，并將加熱時(shí)間延長
b.?確認(rèn)樣本煮沸時(shí)的溫度達(dá)到95-100℃ |
| 確認(rèn)蛋白質(zhì)特性 | 查詢生物信息確認(rèn)蛋白是否存在后修飾、剪切體等。 |
| 抗體濃度過高或蛋白樣品過量 | a.?調(diào)整蛋白上樣量為30-50 ug或減少上樣量
b.?增加抗體稀釋倍數(shù) |
| 抗體非專一性結(jié)合 | a.?增加洗膜次數(shù)與除垢劑強(qiáng)度
b.?設(shè)對(duì)照組確認(rèn)抗體專一性
c.?詢問抗體公司技術(shù)支持 |
| 抗體認(rèn)到輕重鏈的信號(hào) | a.?換不同宿主來源的一抗
b.?使用EasyBlot二抗 |
| 目標(biāo)信號(hào)微弱 |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白問題 | a.?了解靶標(biāo)蛋白的特性
??是否存在特異性??可提取特定細(xì)胞器增加蛋白濃度，例：抽取核蛋白、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白。
??是否存在組織特異性??有些目標(biāo)蛋白只會(huì)在特定組織表達(dá)，這可降低樣本挑選的錯(cuò)誤率。
??是否有后修飾作用??目標(biāo)蛋白后修飾分子量會(huì)變大，使抗體認(rèn)到的位置比估算分子量高。
??確認(rèn)靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞株的表達(dá)量以及是否需加藥誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
b.?增加蛋白質(zhì)上樣量。一般蛋白上樣量為20-30μg/孔,?如文獻(xiàn)已表明靶標(biāo)蛋白表達(dá)量低或是使用極少的上樣量（例如< 10μg），需增加上樣量來協(xié)助抗體偵測(cè)其信號(hào)。
c.?減少蛋白降解。
??細(xì)胞萃取時(shí)要加蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。
??在冰上操作蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)。
??避免反復(fù)凍融樣品(建議分裝)。
??新鮮制備新一批的樣本。 |
| 抗體問題 | a.?調(diào)整抗體孵育條件。
??增加抗體量，例如原本使用1:1000稀釋，調(diào)整為1:500稀釋。
??增加孵育時(shí)間：將原37℃孵育1小時(shí)改成4℃孵育過夜。
b.?一抗二抗不相容。檢查二抗與一抗種屬是否有正確配對(duì)，要訣：“鼠配鼠兔配兔，isotype相配不出錯(cuò)”。
c.?過度洗脫。減少洗脫次數(shù)與時(shí)間：一般洗脫三次,?每次5-10分鐘即可。 |
| 轉(zhuǎn)膜問題 | a.?檢查轉(zhuǎn)膜方向。轉(zhuǎn)膜方向錯(cuò)誤會(huì)讓蛋白往反方向移動(dòng)散逸在轉(zhuǎn)膜緩沖液里，方向正確才能讓蛋白粘附咋轉(zhuǎn)印模的孔洞里。
b.?根據(jù)分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜條件。大分子蛋白轉(zhuǎn)膜條件可調(diào)整為低溫過夜（濕式轉(zhuǎn)膜），小分子蛋白改用0.2 um的轉(zhuǎn)印膜，縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間。 |
| 封閉過度 | a.?降低封閉液濃度：一般使用3-5%的牛奶或BSA做封閉液即可。
b.?降低封閉時(shí)間：一般封閉時(shí)間為30-60分鐘。
c.?換封閉液，可使用商業(yè)化封閉液（GTX30963）可協(xié)助避免這個(gè)問題的發(fā)生。 |
| 化學(xué)發(fā)光底物失活或敏感度不夠 | a.?使用現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光底物
b.?使用高敏感度的化學(xué)發(fā)光底物，例如使用飛克（GTX14698）等級(jí)的化學(xué)發(fā)光底物。
c.?增加曝光時(shí)間 |