FluoroSpot熒光免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)可用于單細(xì)胞水平上檢測多種細(xì)胞因子的分泌。和ELISpot一樣，是一種靈敏、操作簡單的方法。在FluoroSpot實(shí)驗(yàn)中，不同細(xì)胞因子的單抗混合物用到了夾心法中。不同于ELISpot，F(xiàn)luoroSpot使用的是熒光標(biāo)記的檢測試劑。一種分析物用生物素化抗體檢測，另外一種分析物使用tag標(biāo)記的抗體檢測。這種實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)保證了可以在同一孔內(nèi)進(jìn)行2種細(xì)胞因子的檢測。接下來使用紅色熒光標(biāo)記的Streptavidin和綠色熒光標(biāo)記的抗tag抗體進(jìn)行信號的級聯(lián)放大。使用自動熒光讀板儀分析產(chǎn)生的2種顏色的熒光斑點(diǎn)并生成圖像。圖像疊加后上顯示在相同位置的熒光斑點(diǎn)表示為同時分泌2種細(xì)胞因子的細(xì)胞。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??圖1?? FluoroSpot檢測原理 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2? 白色念珠菌提取物處理和未處理的PBMC細(xì)胞(300,000? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? cells/well)過夜培養(yǎng)后，使用FluoroSpot檢測分泌?IFN-γ 和?/? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?或IL-22的細(xì)胞。使用AID (Autoimmun Diagnostika?GmbH)
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?公司的iSpot分析儀進(jìn)行斑點(diǎn)分析。在FITC (IFN-γ)?和 Cy3
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?(IL-22)疊加圖片上相同位置顯示的斑點(diǎn)表示為同時分泌IFN-γ
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?和 IL-22的細(xì)胞。
FluoroSpot試劑盒信息
?人FluoroSot試劑盒 |
?產(chǎn)品名稱 | ?編號 | ?供應(yīng)商 |
?Human IgG/IgA FluoroSpot kit | ?FS-05R06G | ?Mabtech |
?Human IgG/IgM FluoroSpot kit | ?FS-05R17G | ?Mabtech |
?Human IgG/IgA/IgM FluoroSpot kit | ?FS-050617 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/Granzyme B FluoroSpot kit | ?FS-0110 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/Granzyme B FluoroSpot kit, pre-coated | ?FSP-0110 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | ?FS-0102 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit, pre-coated | ?FSP-0102 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-5 FluoroSpot kit | ?FS-0108 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-13 FluoroSpot kit | ?FS-0104 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-17A FluoroSpot kit | ?FS-0103 | ?Mabtech |
?Human IFN-γ/IL-22 FluoroSpot kit | ?FS-0118 | ?Mabtech |
?Human IL-1β/GM-CSF FluoroSpot kit | ?FS-1215 | ?Mabtech |
?Human IL-1β/IL-6 FluoroSpot kit | ?FS-1213 | ?Mabtech |
?Human IL-1β/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | ?FS-1214 | ?Mabtech |
?Human IL-1β/TNF-α FluoroSpot kit | ?FS-1209 | ?Mabtech |
?Human IL-6/GM-CSF FluoroSpot kit | ?FS-1315 | ?Mabtech |
?Human IL-6/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | ?FS-1314 | ?Mabtech |
?Human IL-6/TNF-α FluoroSpot kit | ?FS-1309 | ?Mabtech |
?Human TNF-α/GM-CSF FluoroSpot kit | ?FS-0915 | ?Mabtech |
?Human TNF-α/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | ?FS-0914 | ?Mabtech |
?猴FluoroSot試劑盒 |
?Monkey IgG/IgA FluoroSpot kit | ?FS-05R24G | ?Mabtech |
?Monkey IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | ?FS-2122 | ?Mabtech |
?小鼠FluoroSot試劑盒 |
?Mouse IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | ?FS-4142 | ?Mabtech |
?Mouse IFN-γ/IL-5 FluoroSpot kit | ?FS-4143 | ?Mabtech |
?Mouse IFN-γ/IL-17A FluoroSpot kit | ?FS-4144 | ?Mabtech |
*注意事項(xiàng)
?1.?使用抗CD28抗體對CD28共刺激，可以提高IL-2的分泌
在FluoroSpot實(shí)驗(yàn)中，捕獲抗體對細(xì)胞因子的捕獲可能會影響細(xì)胞因子的分泌。板孔里包被的IL-2捕獲抗體能夠降低游離IL-2的分泌，而游離IL-2對T細(xì)胞活化是必須的。為了補(bǔ)償這種影響，可使用抗CD28單抗進(jìn)行共刺激，在合適的濃度下可以增加特異性抗原的分泌而不會增加自然分泌。其他細(xì)胞因子也有可能會受到捕獲抗體的影響，因此使用抗CD28抗體刺激在很多情況下可以有效的解決這個問題。
2.建議使用帶分離濾光片的自動讀板儀分析
建議使用帶FITC和Cy3濾光片的自動熒光ELISpot分析儀儀分析FluoroSpot。為了準(zhǔn)確的檢測2種細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞，分析儀需要具有對2種濾光片獲得的信號進(jìn)行疊加分析的能力。