線粒體是獨特的哺乳動物細胞器，以細胞的能量工廠著稱，普遍認為是由需氧菌進化而成。線粒體在細胞代謝和細胞凋亡中扮演重要角色。越來越多的研究表明，線粒體在天然免疫中有核心作用，并可能促成炎癥疾病。在感染和應激之后，受損的線粒體釋放其組分，包括線粒體?DNA（mtDNA），后者是一種強效的損傷相關分子模式（DAMP），可通過多種模式識別受體（PRRs）誘導炎癥反應。參與識別mtDNA的主要幾種PRRs是：Toll-like receptor 9 (TLR9)，Nod-likereceptor family，pyrin domain containing 3 (NLRP3)和 cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)。

線粒體DNA類似于細菌DNA，因其包含非甲基化CpG二核苷酸重復序列，后者可被小胞體受體TLR9識別。一些研究表明，由于受損而釋放在胞漿循環(huán)中的mtDNA可直接活化TLR9，從而活化NF-kB，產(chǎn)生促炎性因子如TNF-a和IL-61-3。用TLR9抑制性ODNs1，2或敲除Tlr9基因4，被證實可削弱炎癥反應，因此證實TLR9參與mtDNA的識別。

另外一個炎癥通路，是mtDNA引發(fā)形成NLRP3炎癥小體。最近發(fā)表的數(shù)據(jù)提示，釋放在胞漿中的mtDNA可活化NLRP3炎癥小體，導致caspase-1依賴的促炎性細胞因子IL-1b和IL-18的分泌。去除mtDNA可有效抑制IL-1b和IL-18的分泌，即使細胞被炎癥小體誘導劑刺激5。此外，氧化的mtDNA被證實可直接結合并活化NLRP36。

線粒體DNA也可活化cGAS-STING啟動產(chǎn)生1型干擾素（IFNs）而觸發(fā)炎性反應。最近的文獻表明，在細胞凋亡過程中釋放到胞漿的mtDNA可活化cGAS，產(chǎn)生cGAMP，后者招募STING，下游進一步活化TBK1-IRF3信號通路，產(chǎn)生1型干擾素7，8。另有最新研究表明，皰疹病毒感染引起細胞應激而產(chǎn)生的mtDNA也可活化cGAS-STING信號通路9。

mtDNA觸發(fā)的炎癥反應與自噬密切相關。自噬是一種關鍵的適應機制，多余的胞漿成份（如DNA，蛋白，線粒體和細胞內病原）被雙膜泡 （自噬體）“沒收”，后者與溶酶體融合，降解其中捕獲的胞漿組分，達到清除效果，從而保護細胞避免應激誘導的損傷。另外，自噬可通過調節(jié)如NF-kB10和STING11等關鍵免疫調控器來限制過激的炎癥反應。在如微生物感染和重大創(chuàng)傷的病理狀態(tài)下，功能失調的線粒體和受損mtDNA在胞漿中積累至超出自噬降解能力時，自噬的負向調節(jié)功能隨之喪失。結果導致炎癥反應大幅提升，常伴有慢性炎癥的發(fā)生，后者由于TLR92，12，NLRP35和（或）cGAS-STING13應答異常而引起。mtDNA在線粒體相關疾病，包括感染疾病，自身免疫病和癌癥中的作用機制，還有待于更進一步的研究來解析。

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5. Nakahira K. et al., 2011. Autophagy?proteins regulate innate immune responses by inhibiting?the release of mitochondrial DNA mediated by the?NALP3 inflammasome. Nat Immunol. 12(3):222-30.

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8. Rongvaux A. et al., 2014. Apoptotic caspases prevent?the induction of type I interferons by mitochondrial?DNA. Cell. 159(7):1563-77.

9. West AP. et al., 2015.?Mitochondrial DNA stress primes the antiviral innate?immune response. Nature. 520(7548):553-7.

10. Zhong?Z. et al., 2016. NF-κB Restricts Inflammasome Activation?via Elimination of Damaged Mitochondria. Cell.?164(5):896-910.

11. Saitoh T. et al., 2009. Atg9a controls?dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the?innate immune response. PNAS;106(49):20842-6.

12.?De Leo MG. et al, 2016. Autophagosome-lysosome fusion?triggers a lysosomal response mediated by TLR9 and?controlled by OCRL. Nat Cell Biol. 18(8):839-50.

13. Lan?YY. et al, 2014. Dnase2a deficiency uncovers lysosomal?clearance of damaged nuclear DNA via autophagy. Cell?Rep. 9(1):180-92.

自噬報告基因細胞

自噬通過溶酶體將包漿物質降解，是維持恒定程序的基本要素。這一多步驟程序包括將物質分離入泡膜，形成自噬體，與溶酶體融合，降解和再循環(huán)內容物。研究自噬潮（autophagic flux）的關鍵蛋白是LC3（微管相關蛋白1輕鏈3）。在分離膜形成時，胞漿中的LC3被招募并進入自噬程序，此定位動作被視為自噬膜的特征，用以檢測自噬的生成和發(fā)展。由LC3B融合一個綠色銀光蛋白（GFP）和一個紅色熒光蛋白（RFP）組成的嵌合蛋白，是檢測自噬進程的簡單方法。自噬體形成可被RFP-GFP-LC3標記，顯示RFP和GFP雙信號。與溶酶體融合后，酸性環(huán)境可顯著降低GFP信號，RFP信號卻保持穩(wěn)定。

HeLa-DiFluo? hLC3 Cells
RAW-DiFluo? mLC3 Cells
THP1-DiFluo? hLC3 Cells

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自噬報告基因細胞HeLa-Difluo?hLC3細胞,RAW-Difluo?mLC3細胞和THP1-Difluo?hLC3細胞分別源于人上皮瘤細胞系HeLa，鼠源巨噬細胞系RAW264.7和人源單核細胞系THP-1。這些報告基因細胞全部穩(wěn)定表達RFP::GFP::LC3融合蛋白（RFP-GFP-LC3）：人源或鼠源LC3的N末端融合兩個熒光報告蛋白，RFP（酸性穩(wěn)定）和GFP（酸性敏感）。在這些報告基因細胞中，通過熒光顯微鏡檢測綠色GFP-LC3和（或）紅色RFP-LC3斑點的呈現(xiàn)狀態(tài)，實現(xiàn)RFP-GFP搭配實時檢測自噬潮的功能。在自噬早期，RFP和GFP信號皆可被探知，當進入自噬體與溶酶體融合程序，GFP熒光信號消失，只留下可視的RFP熒光信號。GFP-LC3/RFP-LC3陽性細胞和RFP-LC3陽性細胞的比例可用來評估自噬潮的階段，這一方法已被報道1，2。

HeLa-Difluo? hLC3 cells,RAW-Difluo? mLC3 cells和THP1-Difluo? hLC3 cells對Zeocin?有抗性。

1. Loos B. et al. 2014. Defining and measuring autophagosome flux- concept and reality. Autophagy. 2014;10(11):2087-96.

2. Kimura S. et al., 2007. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent tagged LC

3. Autophagy. 3(5):452-60.

HeLa-Difluo?hLC3細胞被25μM rapamycin 單獨處理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1（抑制自噬體和溶酶體融合）聯(lián)合處理。孵育24小時，用2% PFA固定細胞，并用共聚焦顯微鏡分析結果。請注意在圖片viii中，黃色（自噬體）和紅色（自噬溶酶體）斑點均顯著提升，而圖片ix中的斑點幾乎均為黃色（自噬體）。

自噬誘導劑和抑制劑

自噬是原生分解程序，由細胞內應激物（營養(yǎng)物和能量貧乏）引起。自噬由生成自噬體開始，這一步驟由一系列蛋白調控，包括VPS34的III型磷脂酰肌醇（PI）3激酶復合體，隨后與溶酶體的融合將自噬體酸化。自噬的阻斷有多種方式，例如III型PI3激酶抑制劑可通過抑制自噬捕獲動作而阻斷自噬進程，或者用抑制溶酶體酸化的抑制劑阻止自噬溶酶體的形成和自噬降解。自噬進程是被縝密調控的。mTORC1，一種對營養(yǎng)物和生長因子敏感的激酶，是自噬的主要阻遏器。因此，mTORC1及其信號通路的抑制劑可誘導產(chǎn)生自噬。

原代細胞培養(yǎng)的抗菌劑

Primocin?

原代細胞培養(yǎng)，始終要面對來源于原代器官（如，皮膚或腸道樣本）或周遭環(huán)境中（如實驗室，儀器，實驗人員等）微生物毀滅性污染的威脅。為了保護您的原代細胞免受污染，InvivoGen開發(fā)出一種獨家專利廣譜抗生素，Primocin?。

產(chǎn)品描述
Primocin?通過阻斷微生物DNA和蛋白合成從而去除支原體，細菌和真菌。Primocin?的作用靶點僅存在于微生物中，包括三個細菌靶點（DNA旋轉酶，原核生物核糖體亞單位30S和50S）和一個真菌靶點（麥角固醇，一種僅在真菌和酵母細胞膜發(fā)現(xiàn)的分子）。由于特殊的“雞尾酒”抗生素設計，Primocin?對于某些廣泛存在于實驗室的細菌（如Pseudomonas aeruginosa,Listeria monocytogenes和Bacillus species）甚至比InvivoGen自主研發(fā)的Normocin?處理效果更好。更為重要的是，Primocin?對原代細胞無細胞毒性，這要歸功于其抗真菌劑成分與Amphotericin B比，無毒性且更加穩(wěn)定。

應用及功效
Primocin?在原代細胞分離，培養(yǎng)的文獻中高頻引用。例如，在外周血單核細胞（PBMCs）中分離原代人源自然殺傷（NK）細胞的亞克隆1；從鼠胚胎腦組織中分離星形膠質細胞和神經(jīng)元細胞2。另外，最近的研究證明Primocin?處理干細胞污染的功效，如脆性X綜合癥中人源胚胎干細胞的神經(jīng)誘導3。在Wang et al.等設計的長期培養(yǎng)人源多能干細胞（hPSCs）方案中，使用Primocin?配合InvivoGen抗支原體制劑Plasmocin?來預防細菌和支原體污染，被視為成功分選和培養(yǎng)的“關鍵步驟”4。有些科研團隊將Primocin?應用于先端生物學領域：3D細胞培養(yǎng)和生物人工臟器。例如，Graham et al. 在研究鼠源生物人工結腸中研究內質網(wǎng)應激（ER stress）而產(chǎn)生炎癥和凋亡過程，將Primocin?加入鼠源生物人工結腸培養(yǎng)基，以預防污染5。 類似的研究還有，Weeber和同事用Primocin?確保從結腸直腸癌（CRC）分離的轉移活檢癌類器官可以正常增殖6。Nichols et al.在從原代成年人肺細胞和兒童肺支架建立肺類器官時兩次使用Primocin?：處理肺源組織，以及培樣分離的肺器官和氣管、支氣管細胞7。
雖然Primocin?與其它抗生素完美兼容，但其最大的優(yōu)點是使用Primocin?時，無需添加其它抗生素。在原代細胞培養(yǎng)中，Primocin?可以處理其它抗生素無法殺死的微生物，消除威脅，無疑是您的最佳選擇。例如，最近Cao & Poss在關于斑馬魚心臟外植體培養(yǎng)的文章中指出，Primocin?可降低最初幾天心外膜細胞污染的幾率，然而青霉素/鏈霉素（Pen/Strep）和 Fungizone?（Amphotericin B）的組合并不能避免污染8。
Primocin?也可用于保護無限增殖化細胞系。比如，Pastrana et al.用Primocin?處理293TT，ART，SFT和A549，以確保隨后BK多瘤病毒的感染篩選實驗不受干擾9。
全世界的研究者都信賴Primocin?保護原代細胞不受支原體，細菌和真菌入侵的功效。也請同時關注InvivoGen其它廣譜抗菌劑（請查看相關產(chǎn)品）。

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1. Garcia-Beltran et al., 2016. Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1, Nat. Immunol., 17:1067–1074.

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5. Graham et al., 2016. MEM258 Is a Component of the Oligosaccharyltransferase Complex Controlling ER Stress and Intestinal Inflammation, Cell Rep., 11(13):2955–2965.

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9. Pastrana et al., 2013. BK Polyomavirus Genotypes Represent Distinct Serotypes with Distinct Entry Tropism, J Virol. 87(18):10105–10113.?