由于神經(jīng)退行性疾病的復(fù)雜成因，目前臨床上尚缺乏有效的治療方案，甚至對(duì)疾病病理進(jìn)程也未完全了解。在研究 AD 的過(guò)程中，最先引起科研學(xué)者們注意的相關(guān)蛋白是?β?淀粉樣肽，其出現(xiàn)在 AD 患者的大腦斑塊中，被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元變性甚至死亡的原因[2]。因此最初的藥物和治療方案都是針對(duì)該蛋白，但令人失望的是，這些新藥研發(fā)全軍覆沒(méi)。于是國(guó)內(nèi)外更多的研究重點(diǎn)又放在了 tau 蛋白上。
不過(guò)，隨著越來(lái)越深入的研究，科研學(xué)者們發(fā)現(xiàn)?AD 可能不是單純由某一個(gè)蛋白致病，而是兩種蛋白同時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題共同導(dǎo)致的疾病進(jìn)程[3]，所以，科研學(xué)者決定重新對(duì)?β?淀粉樣肽開(kāi)展研究。
從結(jié)構(gòu)和機(jī)制上來(lái)說(shuō)，β?淀粉樣肽簡(jiǎn)稱 Aβ，是淀粉樣肽前體蛋白（APP）的水解產(chǎn)物。APP 則是一種跨膜整合蛋白，存在于多種組織當(dāng)中，尤其是在 AD 中有重要角色的神經(jīng)元突觸[4]。APP 蛋白水解之后釋放 Aβ，而后聚集沉積，是淀粉樣斑塊的主要成分。Aβ?和 tau 蛋白以及?α?突觸核蛋白都有類似的蛋白聚集機(jī)制，從單體到寡聚體再到原纖維，然后像種子一樣誘導(dǎo)更多單體形成原纖維/聚集體。
從形式和特性上來(lái)說(shuō)，Aβ?肽是單體，主要有兩種形式?Aβ40??和 Aβ42，前者在正常老年人和?AD?患者腦中含量豐富，而后者主要存在于?AD?患者腦中[5]。Aβ42 非常不穩(wěn)定且極其容易聚集，導(dǎo)致研究它的各種結(jié)構(gòu)（單體、寡聚體、原纖維）非常困難[6]。由于 Aβ1-42?在水溶液中是無(wú)結(jié)構(gòu)的，而非極性溶劑可以誘導(dǎo)?α?螺旋結(jié)構(gòu)[7]，所以目前市面上常用的是 HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，一種非極性溶劑）處理的 Aβ?肽，使之穩(wěn)定于單體狀態(tài)。當(dāng) HFIP 中水的含量增加時(shí)，α?螺旋開(kāi)始變成?β?折疊[7]，也就是聚集過(guò)程的開(kāi)始，因此 Aβ?單體在運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中是干粉狀態(tài)，需要防潮，避免水份的加入。
StressMarq?的?β?淀粉樣肽?1-42（Aβ42）為合成肽，在干燥前用??HFIP?處理，從而可以分解前體原纖維并使肽單體化，一些文獻(xiàn)中也使用該方法[8,9]。在 DMSO/dH2O 中重新懸浮后，當(dāng)在 TEM、AFM 和具有抗 Aβ 抗體的蛋白質(zhì)印跡下觀察時(shí)，Aβ42 呈現(xiàn)為不含原纖維的單體肽。值得注意的是，與 Aβ42 寡聚體和原纖維相比，Aβ42 單體對(duì)原代大鼠皮層神經(jīng)元沒(méi)有毒性。
圖 1. 從左至右分別為 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的電鏡圖。負(fù)染色透射電子顯微鏡圖像在 80 Kv 下在碳涂層的 400 目銅網(wǎng)格上使用磷鎢酸和乙酸雙氧鈾染色獲得。比例尺 = 100 nm。
圖 2. 從左至右分別為 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的原子力顯微鏡圖。將 1.0 mg/mL 樣品在 dH2O 中稀釋至 0.1 mg/mL 置于新鮮切割的云母上，清洗、干燥并以輕敲模式進(jìn)行原子力顯微鏡分析。上圖為 2.5 x 2.5 μm x-y，z 范圍為 10 nm。淀粉樣斑塊的出現(xiàn)一直被認(rèn)為是 AD 疾病的象征，但是它出現(xiàn)的數(shù)量和節(jié)奏都與 AD 疾病的進(jìn)程不符，所以近年來(lái)，研究學(xué)者們發(fā)現(xiàn)推動(dòng)疾病進(jìn)程更多的可能是 Aβ?寡聚體和原纖維。制作寡聚體和原纖維的步驟在很多文獻(xiàn)都有描述[8~10]，以下圖表為常用的處理方法：
圖 3. Aβ?寡聚體和原纖維制作流程[10]
StressMarq 的 Aβ42 寡聚體使用 Aβ?肽由特殊方法制得，F(xiàn)12 細(xì)胞培養(yǎng)基方法也在投入生產(chǎn)。Aβ42 寡聚體在電子顯微鏡（圖 1）和原子力顯微鏡（圖 2）下顯示出明顯的球狀結(jié)構(gòu)，而在 WB（圖 4）中使用抗 Aβ?抗體顯示出獨(dú)特的二聚體/三聚體和寡聚體信號(hào)。同時(shí)?Aβ?寡聚體對(duì)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元有毒性（圖?5）。Aβ42 原纖維使用 Aβ?肽由 HCl 方法制得，在電子顯微鏡（圖 1）和原子力顯微鏡（圖 2)下顯示出明顯的長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，而在 WB（圖 4）中使用抗 Aβ?抗體顯示出獨(dú)特的高分子量信號(hào)。同時(shí)?Aβ?原纖維對(duì)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元有毒性（圖?5）。
圖 4. 從左至右分別是 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的 WB，抗體是抗 Aβ6E10?抗體。三種 Aβ?蛋白（160 pmol）在 4%~12% Bis-Tris SDS-PAGE 上跑膠后，在 0.02% v/v Tween-20 存在下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用 1:1000 小鼠 6E10 一抗做 WB。在 TEM/AFM 下觀察到的寡聚體顯示出明顯的二聚體/三聚體條帶以及來(lái)自 ~37-75 kDa 的信號(hào)（中）。在 TEM/AFM 下觀察到的原纖維顯示出大于 100 kDa 的信號(hào)，并且在濃縮膠（右）中有明顯的信號(hào)。
圖 5. Aβ 1-42 寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）對(duì)原代大鼠皮層神經(jīng)元顯示出劑量依賴性毒性，但單體（SPR-485）沒(méi)有毒性。大鼠原代皮層神經(jīng)元用不同濃度的（A）單體、（B）寡聚體或（C）原纖維處理 14 天后的存活率，由 MAP2 陽(yáng)性神經(jīng)元量化并表示為對(duì)照的百分比（空白對(duì)照設(shè)為 100%）。原纖維和相應(yīng)的載體對(duì)照先在 Bioruptor 超聲破碎儀中進(jìn)行超聲處理。測(cè)試條件在與未處理的對(duì)照和載體對(duì)照相同的板中運(yùn)行，由不含 Aβ 1-42 蛋白的緩沖液組成。數(shù)據(jù)表示為平均值 +/- s.e.m.（n = 6）。使用單向方差分析和 Dunnett 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全局分析；**?p?p?p?
總的來(lái)說(shuō)，StressMarq 的 Aβ 單體、寡聚體和原纖維都可以應(yīng)用于 WB，以及體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。StressMarq 的 Aβ 寡聚體在毒性方面有潛力成為更好的建模工具，更多數(shù)據(jù)或產(chǎn)品詳情，可聯(lián)系一級(jí)代理商-欣博盛生物
參考文獻(xiàn)：
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