? ? ? ?帕金森是第二大老齡化相關的神經衰退疾病。主要的生物化學改變?yōu)樯窠浽挟a生不溶性“路易小體”，其主要的成分是聚集的α突觸核蛋白。α突觸核蛋白在神經衰退類疾病中扮演著重要角色，如路易體癡呆，多系統(tǒng)萎縮癥和帕金森，這些疾病統(tǒng)稱為突觸核蛋白病。在這些疾病中，α突觸核蛋白集合形成更大的聚合體，也就是路易體和營養(yǎng)障礙性神經突。α-突觸核蛋白是高度易溶的，沒有內部結構的小分子蛋白，廣泛存在于大腦中，主要分布于神經元突觸前體內。α突觸核蛋白參與突觸小泡的信號分子釋放，包括多巴胺，對機體運動非常重要。α突觸核蛋白寡聚體（oligomers）具有神經毒性，能以類似朊病毒的方式擴散致病。

? ? ? ?α突觸核蛋白是一種分子量為14KD的蛋白，主要存在于中腦黑質中的神經元突觸前體，目前還不能完全了解其功能。α突觸核蛋白的非淀粉樣蛋白部分，又稱NAC 區(qū)域，由中段憎水區(qū)構成，是形成蛋白聚集的必要區(qū)域。α突觸核蛋白單體可以形成各種類型的寡聚體。隨著寡聚體形成可溶性原纖維或纖維細絲，蛋白聚集也在持續(xù)進行。纖維細絲經過結構變化，從α螺旋結構變成β折疊，然后形成不溶性纖維。這些各種類型的蛋白以動態(tài)平衡的形式同時存在。

? ? ? ?StressMarq公司是神經衰退疾病研究工具行業(yè)的領先制造商，是活性α突觸核蛋白單體，寡聚體，前體原纖維的獨家生產商。前體原纖維，又稱PFF。PFF是制作帕金森疾病模型的重要工具，它們可以大大加速α突觸核蛋白單體的聚集。

? ? ? ?在體外通過硫磺素T作為指示劑，當?shù)鞍拙奂瘯r形成β折疊時，可以看到增強的熒光信號，這是蛋白聚集的一種固有現(xiàn)象。將PFF加入到原代神經元中或者注射到嚙齒動物大腦中，都可造成蛋白聚集和α突觸核蛋白病理現(xiàn)象。路易體病理現(xiàn)象從注射點開始蔓延，可用129號位絲氨酸磷酸化的抗體來識別，這是可視化α突觸核蛋白病理現(xiàn)象的最佳方法。將?PFF注射到動物腦中制作病理模型，比使用基因改造模型要快10到15倍。該方法制作疾病模型的時間要遠遠短于傳統(tǒng)的基因改造小鼠、大鼠。通常注射后30天即可見到病理反應，而基因改造模型需要9個月到1年時間。為帕金森造模提供了極大的便利。α突觸核蛋白PFF還可以結合熒光標記， 用于蛋白示蹤。雖然路易體病理現(xiàn)象是突觸核蛋白病的最先出現(xiàn)的癥狀, 但是α突觸核蛋白寡聚體在疾病進程中也扮演重要角色，因為它們有很強的神經毒性。α突觸核蛋白可以被穩(wěn)定在寡聚體形式，加入到疾病模型中誘發(fā)毒性。

? ? ? ?StressMarq的α突觸核蛋白產品線包括原纖維，寡聚體和抗體，可以用于研究α突觸核蛋白的病理學和毒性特征。這給科研學者提供了有力的工具，用來構建疾病模型，檢測新藥，一起攻克神經衰退疾病治愈難題。

? ? ? ?StressMarq目前提供人源和小鼠源前體原纖維（PFFs）以及單體用于帕金森造模的研究。所有蛋白都進行了細胞檢測和ThT檢測。TEM 圖片、ThT檢測曲線以及其他檢測結果可以在產品單頁上看到。A53T α-突觸核蛋白單體和PFFs也上線了。A53T突變型被認為與早發(fā)型帕金森疾病有關并且加速α-突觸核蛋白的纖維聚化。

? ? ? ?大鼠原代海馬神經元經過 1 型 小鼠α-突觸核蛋白PFFs處理后顯示出路易小體病理現(xiàn)象。

? ? ? ?大鼠腦注射了1型小鼠α-突觸核蛋白 PFFs (SPR-324) 后的IHC分析，顯示了α-突觸核蛋白病理現(xiàn)象.

? ? ? ?StressMarq目前正在研發(fā)更多的原纖維新品用于神經衰退疾病研究，并且也在完善我們現(xiàn)有的產品線。下面表格列出了各種蛋白的區(qū)別：

? ? ? ?3型PFFs (使用新型支架制作) 與1 型 PFFs 結構和活性都相似，但是內毒素水平較低與2 型 PFFs 相似。 PFFs 不可溶而蛋白纖維可溶，但是可能根據操作手法不同會有少量不溶原纖維。抑制劑可以停滯alpha突觸核蛋白的聚集，阻止寡聚體形成原纖維。以下是抑制劑阻滯的寡聚體:

? ? ? ?只含有抑制劑-阻滯的寡聚體的ThT檢測在24小時內沒有顯示熒光強度增強，當與1型單體混合時熒光強度有所增加。 但是這個增加比單獨1型單體的增加要少。這說明這些抑制劑-阻滯的寡聚體減緩了單體的聚集。

? ? ? ?ThT是一種熒光染料，可以綁定富含beta折疊的結構, 例如alpha 突觸核蛋白原纖維. 抑制劑介入-鹽酸多巴胺處理的寡聚體(SPR-466)顯示的熒光強度和單體(SPR-321)相比要少得多。單體和抑制劑介入的寡聚體混合后顯示的聚集作用很有限。

? ? ? 大鼠活體注射帕金森建模和檢測實驗

? ? ? ?該實驗操作指南是將1型小鼠PFFs(SPR-324)或1型人PFFs(SPR-322)注射到大鼠腦中來產生alpha突觸核蛋白病理特征。小鼠PFFs顯示出了更強的聚集效果。

使用的動物: 雌性 SD(Sprague Dawley) 大鼠

? ? ? 2uLPFFs或者單體 (陰性對照) 通過以下兩個腦頂葉區(qū)的位置注射：

? ? ??● AP+1.6,ML+2.4,DV–4.2

? ? ??●?AP–1.4,ML+0.2,DV–2.8

? ? ??30天后, 用生理鹽水灌注大鼠然后在大鼠腦冠狀平面切開，將中腦與前腦分開。之后兩部分都用4%PFA 固定48小時。

?

? ? ??DAB 操作步驟

? ? ??材料

? ? ??●?1XTBS (含有和不含有TX-100的)

? ? ??●?30%?H₂O₂

? ? ??●?檸檬酸緩沖液

? ? ??●?驢血清(保存在-20℃;凍融穩(wěn)定的)

? ? ??●?一抗：pSYN EP1536Y?(Abcam; ab51253)

? ? ??●?二抗：生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驢抗兔 IgG (H+L)?(Jackson Immuno; 貨號: 711-065-152)

? ? ??●?ABC 試劑?(Vector; 貨號: PK-7100)

? ? ??●?DAB 試劑?(Vector; 貨號: SK-4100)

? ? ??●?孔板 (規(guī)格取決于要染色的區(qū)域數(shù)量)

? ? ??●?漆刷

? ? ??●?玻璃鉤

? ? ??●?漂白劑

? ? ??●?ddH20

? ? ??●?BD Luer-lock 注射器 10 mL

? ? ??●?過濾器 0.22 uM 孔徑 (Fisher 貨號. SLMP025SS)

? ? ??●?100% EtOH

? ? ??●?Histoclear (用于清理組織)

? ? ??●?顯微鏡載玻片和蓋玻片

? ? ??●?Permount (封片劑)

?

? ? ??第一天：(猝滅, 抗原修復, 阻斷, 一抗)

? ? ??→ 用 1X TBS (震蕩, 室溫)沖洗切片 5 次以除去冷凍保護劑。

? ? ??→?把切片放到 0.6% H2O2?的 TBS 中，覆蓋好，置于操作臺 20 分鐘。

? ? ??*該步驟不要用 MESH WELLS*

? ? ??用?_______?mL TBS,?_______?uL 30% H2O2

? ? ??→?用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。

? ? ??→?做抗原修復時, 提前在水浴中預熱檸檬酸緩沖液至少 15~30 分鐘。在檸檬酸緩沖液中培養(yǎng)切片一小時，將溫度設置為 37℃，不要震蕩?。

? ? ??→?用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。

? ? ??→?阻斷時, 將切片置于 5% 常規(guī)驢血清和 0.25% Triton-100 的 TBS 中阻斷 1 小時，冷室、震蕩。

? ? ??*注意: 可以使用含有 Triton 的 TBS 阻斷液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻斷液中加入驢血清來阻斷。*

? ? ??用?_______?mL TBS,

? ? ??_______?uL 驢血清,?_______?uL 10% TX-100

? ? ??→?用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。

? ? ??→?用含?5% 驢血清的 TBS 制備一抗溶液，稀釋度為?1：5000。用錫紙包好切片，和抗體一起在冷室中震蕩培養(yǎng)過夜。

? ? ??用?_______?mL TBS,

? ? ??_______?uL 驢血清,?_______?uL pSYN EP1536Y

?

? ? ??第二天：(二抗, ABC 擴大信號, DAB 染色)

? ? ??→?用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片 3 次. 余下的步驟中，需要一直將切片保留在錫紙里，即使是沖洗的步驟。

? ? ??→?用含 5% 驢血清的 TBS 制備二抗溶液，稀釋度為?1：500。在冷室中培錫紙養(yǎng)蓋好的切片 2 小時，震蕩。

? ? ??用?______mL TBS,

? ? ??______?uL 驢血清,?_______?uL 生物素標記的驢抗兔 IgG

? ? ??→?用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片 3 次。

? ? ??→?用 ABC 試劑培養(yǎng)切片 30 分鐘 (震蕩, 冷室)。

? ? ??→?用 1X TBS 沖洗切片 3 次 (震蕩，室溫)。

? ? ??→?用 falcon 離心管和 ddH2O 制備 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后渦旋混合:

? ? ??2滴緩沖溶液

? ? ??4滴 DAB 溶液

? ? ??2滴過氧化氫溶液

? ? ??*注意: 所有接觸過DAB 的器具只能用來操作 DAB。我們還在通風櫥內準備了一個 DAB 專用的廢液缸。使用玻璃鉤來處理 DAB 溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白劑沖洗玻璃鉤。盛裝過 DAB 的器皿都需要用漂白劑沖洗并且處理到生物性危害箱中。*

? ? ??→?用注射器過濾到新的6孔板中。每一個需要染色的腦切片都用一個新的 DAB 孔。

? ? ??→?在DAB中培養(yǎng)每個切片直到變?yōu)闇\棕色(2-3分鐘就足夠; 時間太長可能會造成背景染色太多)

? ? ??→?用 ddH2O沖洗3次

? ? ??→?在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥過夜。

?

? ? ??第三天：(脫水和蓋玻片)

? ? ??*注意: 在開始脫水步驟之前，確保浸片用的玻璃皿里有足夠的液體可以蓋過切片上的所有組織。*

? ? ??→?按照如下順序和時間脫水切片：

? ? ??1.30秒ddH20

? ? ??2.3分鐘70% EtOH

? ? ??3.3分鐘95% EtOH

? ? ??4.3分鐘95% EtOH

? ? ??5.3分鐘100% EtOH

? ? ??6.3分鐘100% EtOH

? ? ??*置于振蕩器*

? ? ??7.5分鐘 Histoclear

? ? ??8.5分鐘 Histoclear

? ? ??9.5分鐘 Histoclear

? ? ??→?將切片從切片籃從取出，一次一片，置于吸水紙上。

? ? ??→?加封片劑時，取一個 P1000 移液器和吸頭，將吸頭尖剪掉，容量設到 400 到 500 μL.

? ? ??→?連續(xù)滴幾滴封片劑 Permount 到切片的中間，傾斜切片使封片劑完全覆蓋切片。

? ? ??→?用棉棒的木頭一端趕出切片中的氣泡。

? ? ??→?將切片放在吸水紙上，置于操作臺上過夜晾干。

? ? ??*注意: ~24 小時之后, 多余的 Permount 封片劑應該用 Histoclear 移除*

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