一、熒光知識(shí)
熒光素按激發(fā)光波長(zhǎng)來(lái)分，主要是激發(fā)波長(zhǎng)為375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4類，其中，常用的是激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和633 nm的熒光素，如FITC、PE、APC、PI等。
激發(fā)波長(zhǎng)為488nm的熒光素
1) 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：FITC是應(yīng)用最為廣泛的一種熒光素，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出明亮的黃綠色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。FITC的熒光強(qiáng)度受PH影響較大，常隨著PH的降低而減弱，因此，在使用FITC時(shí)需格外注意溶液的酸堿度。
2) Alexa Fluor 488：Alexa Fluor是美國(guó)分子探針公司開(kāi)發(fā)的系列熒光染料，Alexa Fluor 488的發(fā)射光譜與FITC幾乎一致，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為519 nm，但其熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性要優(yōu)于FITC。一般來(lái)說(shuō)，Alexa Fluor 488在pH 4-10范圍內(nèi)能保持較好的光穩(wěn)定性。
3) 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是從紅藻中分離純化獲得的一種常見(jiàn)染料，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出橙黃色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為575 nm。PE具有吸光性能好和光量子產(chǎn)率高的特點(diǎn)，可用于標(biāo)記表達(dá)水平較低的蛋白。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，PE標(biāo)記的抗體適用于所有配備488 nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀。
4) PE-Cy5：PE-Cy5是一種復(fù)合染料，屬于藻紅蛋白偶聯(lián)物，在此類復(fù)合染料中，激發(fā)能量可從PE傳遞到Cy5上，最大發(fā)射波長(zhǎng)為667 nm。由于PE-Cy5與FITC、PE在光譜上重疊范圍較少，熒光干擾少，因此實(shí)驗(yàn)中常將PE-Cy5與FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不適合與APC搭配使用，兩者熒光重疊大。
5)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一種復(fù)合染料，能量從PE傳遞到Cy5.5上，最大發(fā)射波長(zhǎng)為694 nm。同PE-Cy5不一樣，PE-Cy5.5與FITC、PE、APC間熒光干擾小，可搭配使用，且其熒光強(qiáng)度要優(yōu)于PE-Cy5。
6) PE-Cy7：復(fù)合染料，最大發(fā)射波長(zhǎng)為785 nm。PE-Cy7與FITC無(wú)光譜重疊，與APC重疊也較少，因此其可與FITC、PE、APC搭配使用。在實(shí)驗(yàn)中需要注意，PE-Cy7的光淬滅性很強(qiáng)，需要絕對(duì)避光環(huán)境。
7) PerCP-Cy5.5：復(fù)合染料，最大發(fā)射波長(zhǎng)為695 nm。與PerCP相反，PerCP的光量子產(chǎn)率較低，適用于表達(dá)水平較高物質(zhì)的檢測(cè)，PerCP-Cy5.5光量子產(chǎn)率高，可用于表達(dá)水平較低物質(zhì)的檢測(cè)。在雙激光管儀器上與APC共同檢測(cè)時(shí)，需要做補(bǔ)償調(diào)節(jié)，但比PerCP補(bǔ)償少。
8) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為617 nm和647 nm，是常見(jiàn)的熒光染料，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，可用于鑒別死、活細(xì)胞。在大部分流式細(xì)胞儀上，PI在FL2或FL3通道檢測(cè)，7-AAD在FL3通道檢測(cè)。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品。
激發(fā)波長(zhǎng)為633nm的熒光素
1) 別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大發(fā)射波長(zhǎng)為660 nm，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細(xì)胞儀，檢測(cè)通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是經(jīng)典3色搭配。
2) Cy5：Cy5屬于小分子染料，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為670 nm，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備633 nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀，檢測(cè)通道一般是FL4通道。除流式細(xì)胞術(shù)外，Cy5同樣適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)。需注意的是，Cy5與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的非特異性結(jié)合多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
3) Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一種明亮的紅色熒光染料，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為668 nm，一般在流式細(xì)胞儀的FL4通道檢測(cè)。Alexa Fluor 647具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、適宜的pH范圍廣和不易淬滅等特點(diǎn)，是APC和Cy5的優(yōu)質(zhì)替代品。
二、熒光素的選擇
在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，各種熒光素標(biāo)記的抗體是必不可少的。那么熒光素該如何選擇呢，通常會(huì)參考以下5個(gè)方面：
1. 流式細(xì)胞儀配置：儀器需滿足激光管可激發(fā)相應(yīng)的熒光素且可同時(shí)檢測(cè)所需的熒光。附常見(jiàn)熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)：
2. 染料的亮度與抗原表達(dá)量相匹配：低表達(dá)抗原，推薦使用亮熒光染料；高表達(dá)抗原，推薦使用弱熒光染料。
3. 熒光染料重疊最小化：盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如FITC/PE-Cy7；選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC，PE/APC。
光譜重疊嚴(yán)重的熒光素同時(shí)檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致熒光溢漏，需調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
4. 避免復(fù)合染料聯(lián)合使用帶來(lái)的假陽(yáng)性：常見(jiàn)的復(fù)合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，復(fù)合染料的信號(hào)衰退會(huì)降低APC或PE的靈敏度。如果出現(xiàn)信號(hào)衰退，則：
● 減少樣本暴露于光、高溫或固定劑；
● 選擇染料時(shí)考慮：復(fù)合染料的信號(hào)衰退會(huì)降低APC或PE的靈敏度，避免染料和其衍生物在同一細(xì)胞上標(biāo)記。選擇更穩(wěn)定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；
● 如果樣本需固定，選擇穩(wěn)定、可有效阻止復(fù)合染料信號(hào)衰退的固定劑多聚甲醛：冰上固定10min，離心除去多聚甲醛，將樣品重懸于PBS中。
5. 盡量使用紅色激光激發(fā)自發(fā)熒光高的樣本：每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光。所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)迅速降低。對(duì)自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞，選擇紅光激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值；對(duì)自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素對(duì)S/N提高沒(méi)有明顯的改善，可選用FITC。
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