ProImmune 的 ProMap? T 細胞增殖檢測可用于鑒定引發(fā)輔助 T 細胞增殖并因此可能引起輔助 T 細胞免疫反應的表位序列。
與基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)測定不同，該測定利用強大的流式細胞術方法，能夠準確測定增殖細胞的百分比和 T 細胞反應的詳細表型，所有這些都顯著提高了整體靈敏度。
為什么選擇 ProMap? CFSE 增殖檢測？
1.CFSE 染料稀釋是一種久經(jīng)考驗的方法，已被數(shù)以千計的出版物引用
2.比放射性分析靈敏得多
3.流式細胞儀讀數(shù)可解析要分析的正確細胞群，例如活 CD4+ T 細胞
4.可以輕松添加進一步的子集表型，并且可以同時讀出子集的增殖
5.積分測定測量增殖時間范圍內(nèi)的所有增殖，而不是孵育時間結(jié)束時的時間窗口
主要出版物：
使用英國國防部下屬的 [dstl] 發(fā)布的 ProMap? T 細胞檢測驗證抗體人源化
Figure 1：比較小鼠和抗體人源化 V 區(qū)中重疊的肽 T 細胞反應
O’Brien LM, Goodchild SA, Phillpotts RJ, Perkins SD. Virology (2012) 426(2):100-5.[PMID:22341308]
英國政府國防科技實驗室 [dstl] 的科學家使用 ProImmune 的 T 細胞增殖檢測來驗證他們對抗委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 (VEEV) 抗體的人源化。序列人源化是一種將抗體中的動物蛋白序列替換為人蛋白序列的合理設計方法。然而，這種方法并不能保證所得到的生物制劑具有低免疫原性。通過在體外 T 細胞分析中使用序列掃描，可以生成抗原性數(shù)據(jù)以顯示嵌合序列和人源化序列之間的差異。在此處閱讀完整的案例研究
ProMap? T 細胞檢測和肽/蛋白質(zhì)療法
這個 ProMap? T 細胞增殖檢測已開發(fā)用于鑒定潛在 T 細胞表位的存在與否，可用于新肽或蛋白質(zhì)的臨床前發(fā)現(xiàn)。這些檢測可以解決結(jié)構相似分子之間的“相對免疫原性”問題；例如，它們可以幫助區(qū)分不同的候選物，或者可以指示蛋白質(zhì)工程策略在潛在免疫治療劑的去免疫化方面是否成功。
作為 ProImmune’s REVEAL? 免疫原性系統(tǒng)的一部分，ProMap? T 細胞增殖檢測的結(jié)果可以與 50 多個 II 類 HLA 等位基因的無細胞 HLA 肽結(jié)合測定的結(jié)果一起分析。這為客戶提供了輔助 T 細胞對一種或多種藥物先導物的免疫反應的詳細資料。
Figure 2: ProMap? T 細胞增殖測定原理。
20-50 個 HLA 型供體的 PBMC 選自 ProImmune 生物庫
根據(jù)項目要求合成肽庫
供體 PBMC 用 CFSE 染料標記
每個肽都與來自每個供體的 PBMC 共培養(yǎng)
響應肽的 CD4+ T 細胞增殖導致 CFSE 標記稀釋
CFSE 的流式細胞術分析結(jié)合 CD4 染色，用于定量細胞分裂，并提供抗原性的測量
ProMap? T 細胞增殖檢測的詳細信息
細胞用熒光染料 5,6-carboxyflurescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) 標記。那些響應抗原而增殖的細胞顯示出 CFSE 熒光強度的降低，這是通過流式細胞術直接測量的。由于這是一種流式細胞分析，它可以準確地確定增殖 CD4+ 細胞的百分比，能夠?qū)?T 細胞反應進行詳細的表型分析，并且比基于放射性胸苷摻入的傳統(tǒng)分析更靈敏。
ProImmune 提供兩種類型的 T 細胞增殖檢測：
用于肽表位作圖的 ProMap? T 細胞檢測
該測定用于鑒定可引發(fā)輔助性 CD4+ T 細胞增殖并因此可能引起輔助性 T 細胞免疫反應的肽表位序列，從而可能導致抗藥抗體 (ADA) 反應或其他不需要的免疫原性。該測定還可用于評估蛋白質(zhì)序列的有益免疫原性，例如用于免疫治療的表位發(fā)現(xiàn)。
在該檢測旨在關注 CD4+ 輔助 T 細胞反應的情況下，CD8+ T 細胞耗盡和 CFSE 標記的供體 PBMC 與 5uM 的每種目標肽在六個重復孔中培養(yǎng) 7 天。每個測定板包括一組未處理的對照孔。該檢測還包括參考抗原對照，包括已知 MHC II 類抗原的合成肽和兩種有效的全蛋白抗原。
Figure 3. 來自 na?ve T 細胞測定的示例染色數(shù)據(jù)，(1) CFSE 標記的 T 細胞單獨在培養(yǎng)基中培養(yǎng)（未刺激），(2) CFSE 標記的 T 細胞與來自目標抗原的肽一起培養(yǎng)，(3) CFSE 標記的 T 細胞用對照蛋白（結(jié)核菌素 PPD）培養(yǎng)。
細胞增殖通過流式細胞術分析確定。對于 ProMap? T 細胞檢測，通過與未刺激樣品的結(jié)果進行比較，確定每個刺激樣品的高于背景的刺激百分比。每個樣本中 CD4+ CFSE 暗淡群體的計數(shù)表示為總 CD4+ 群體的比例。六個重復值用于計算高于背景的刺激百分比（有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗淡細胞的比例，減去沒有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗淡細胞的比例）。
平均值和平均值的標準誤差是從六份值計算出來的。如果高于背景的百分比刺激大于 0.5% 并且高于背景的 2 倍標準誤差，則結(jié)果被認為是“陽性”，盡管數(shù)據(jù)也提供了不太嚴格的閾值以允許考慮小響應。
為了比較肽，計算響應指數(shù)。該指數(shù)基于每種肽的反應幅度（高于背景的刺激百分比）乘以每種肽的反應供體數(shù)量（抗原性百分比）。
報告中提供的數(shù)據(jù)是：
Figure 4. 使用 ProMap? T 細胞增殖檢測測量的抗原性百分比：一組 43 名供體用于測試來自兩種治療性單克隆抗體 Remicade 和 Humira 重鏈區(qū)域的肽的潛在免疫原性。每個供體用不同的顏色表示。引起 2 個或更多供體反應的肽被認為值得進一步研究。
Figure 5. ProMap? T 細胞增殖檢測的反應指數(shù)：來自與圖 3 相同檢測的數(shù)據(jù) – 反應指數(shù)表明對測試肽的反應的幅度和數(shù)量。請注意，PPD 的響應不在此圖的范圍內(nèi)。