說(shuō)到預(yù)實(shí)驗(yàn)，相信做科研的你們一定不陌生。預(yù)實(shí)驗(yàn)是開(kāi)展正式實(shí)驗(yàn)前必不可少的環(huán)節(jié)之一，主要用于摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件及確定實(shí)驗(yàn)的可行性。而使用商品化的ELISA試劑盒，實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)流程都已確定，為什么還要浪費(fèi)時(shí)間且耗費(fèi)試劑去做預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/p>

下面我們就來(lái)聊聊ELISA實(shí)驗(yàn)中的預(yù)實(shí)驗(yàn)，為什么要去做預(yù)實(shí)驗(yàn)：

1. 熟悉實(shí)驗(yàn)操作 不同的商業(yè)化的試劑盒產(chǎn)品，對(duì)于操作細(xì)節(jié)都會(huì)有所差異。比如試劑盒的溫育溫度，有些是4度，有些是常溫，還有些需要在37度恒溫條件下反應(yīng)。使用商業(yè)化的試劑盒，需要嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)要求完成實(shí)驗(yàn)，不要因?yàn)椴僮鞑襟E與平時(shí)的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣不同，就隨意改變說(shuō)明書(shū)中的操作，導(dǎo)致不理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在正式實(shí)驗(yàn)之前，熟悉下整體實(shí)驗(yàn)操作流程是有必要的。

2. 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案 做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以記錄下使用過(guò)程中出現(xiàn)的疑問(wèn)，得到結(jié)果后，進(jìn)行總結(jié)分析，并可聯(lián)系試劑盒廠家的技術(shù)人員給出建議，確保正式實(shí)驗(yàn)有序進(jìn)行。?

3. 預(yù)測(cè)樣本量，確定樣本最適稀釋倍數(shù) 商業(yè)化的試劑盒在出廠驗(yàn)證時(shí)，會(huì)測(cè)定不同種類的樣本，確定試劑盒測(cè)樣的有效性。通常，對(duì)于成分穩(wěn)定的血清血漿樣本，可根據(jù)說(shuō)明書(shū)中推薦的稀釋倍數(shù)完成實(shí)驗(yàn)。另外，由于試劑盒廠家獲取樣本的渠道有限，一般只能驗(yàn)證正常個(gè)體的血清血漿樣本，而某些靶標(biāo)物在疾病、服用藥物等生理狀態(tài)下，表達(dá)量也會(huì)不同，這種情況下，也需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定樣本最適稀釋倍數(shù)后，再進(jìn)行大量樣本的測(cè)定。 不同于血清血漿，有些樣本存在諸多影響靶標(biāo)物含量的干擾因素，如：組織樣本的干擾因素包括：組織類型、提取方式、刺激處理方式等；細(xì)胞樣本的干擾因素包括：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間、刺激處理方式等；尿液&唾液&乳汁樣本的干擾因素包括：飲水量、采樣時(shí)間、采樣方式等。這些干擾因素均會(huì)直接影響樣本中靶標(biāo)物的濃度，建議實(shí)驗(yàn)前先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，預(yù)測(cè)樣本中靶標(biāo)物的含量，確定樣本最適稀釋倍數(shù)，再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。還有一些特殊樣本，如：**灌洗液、**、齦溝液，試劑盒生產(chǎn)廠家不易獲取，也不會(huì)用于試劑盒的驗(yàn)證，且相關(guān)的研究報(bào)道不多，這類樣本也有必要先做預(yù)試驗(yàn)，摸索合適的樣本稀釋倍數(shù)，再開(kāi)展正式實(shí)驗(yàn)。 顯然，預(yù)試驗(yàn)不僅不會(huì)造成試劑和樣本的浪費(fèi)，用少量的樣本和試劑完成預(yù)試驗(yàn)確保正式實(shí)驗(yàn)大量樣本的測(cè)定能夠有序進(jìn)行，經(jīng)濟(jì)且省時(shí)省力。?

如何設(shè)計(jì)ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)？

1. 實(shí)驗(yàn)樣本的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)一般通過(guò)測(cè)定少數(shù)有代表性的樣本來(lái)確定正式實(shí)驗(yàn)方案。如何選擇有代表性的樣本開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)?？通常，測(cè)定的樣本會(huì)分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理or刺激后，靶標(biāo)物的表達(dá)量會(huì)產(chǎn)生變化，建議從各組樣本中隨機(jī)選擇1-2例樣本。如果正式實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣本數(shù)量多，分配到預(yù)實(shí)驗(yàn)的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標(biāo)物含量最低組的樣品，另1例為理論上靶標(biāo)物含量最高組的樣品。

2. 最適稀釋倍數(shù)的確定 將樣本梯度稀釋，可根據(jù)樣本中靶標(biāo)物的濃度，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的制備需按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標(biāo)曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點(diǎn)（如空白孔、最低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。將測(cè)定的不同稀釋濃度的樣本測(cè)定的O.D.值與梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品O.D.值進(jìn)行對(duì)比，最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部/絕大多數(shù)樣本O.D.值能夠位于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度孔對(duì)應(yīng)的O.D.值，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳擬合區(qū)域。需要注意的是在做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要設(shè)置標(biāo)曲，不設(shè)置標(biāo)曲，就如同在丈量時(shí)沒(méi)有尺一樣，無(wú)法通過(guò)比較確定最適稀釋倍數(shù)。

3. 顯色時(shí)間的確定 顯色是ELISA實(shí)驗(yàn)中最后一步溫育反應(yīng)，固定在酶標(biāo)板上的酶催化無(wú)色底物生成有色產(chǎn)物。由于ELISA實(shí)驗(yàn)會(huì)受到環(huán)境差異及實(shí)驗(yàn)操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會(huì)推薦固定的顯色時(shí)間，而是建議實(shí)驗(yàn)操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應(yīng)時(shí)間。加入底物后可定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀察一次），當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)熟悉操作的同時(shí)，也能確定合適的顯色時(shí)間。

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