DC-CIK 細(xì)胞的制備方法

2021-05-08

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CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞”。CIK 是單個(gè)核細(xì)胞在CD3 單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，其既具有T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK 細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK 細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。
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? DC?是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細(xì)胞”，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由2011 年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman 于1973 年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實(shí)，DC 是唯一能夠顯著刺激初始T 細(xì)胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它種類的APC(如單核巨噬細(xì)胞，B 細(xì)胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T 細(xì)胞，因此DC 是機(jī)體適應(yīng)性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。

? ? DC-CIK 即DC 和CIK 細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴(yán)格的說，最終的效應(yīng)細(xì)胞是經(jīng)DC 體外活化的CIK 細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，DC 與CIK 具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC 表面共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK 的增殖能力和體內(nèi)外細(xì)胞毒活性也得以增強(qiáng)，因此DC-CIK 較單獨(dú)的CIK 治療更為有效。若將腫瘤抗原負(fù)載的DC 與CIK 共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T 細(xì)胞，這樣的DC-CIK 治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負(fù)載腫瘤抗原的DC 刺激活化的CIK 活性更強(qiáng)，常被用于臨床和科研。

【步驟簡(jiǎn)圖】

【培養(yǎng)原理】

1．DC?培養(yǎng)用細(xì)胞因子：

GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)：

GM-CSF 是最早被鑒定出對(duì)DC 培養(yǎng)有作用的細(xì)胞因子之一，在DC 培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面MHC II 類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF 也可促進(jìn)DC 的存活。

IL-4 (白細(xì)胞介素-4)

IL-4 在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC 的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC 方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。同時(shí)，IL-4 還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14 分子的能力。CD14 表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC 的重要標(biāo)志。

TNF-α (腫瘤壞死因子-α)

TNF-α可下調(diào)未成熟DC 的巨胞飲作用和表面Fc 受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHC II 類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面MHC I 類、II 類分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表達(dá)，使未成熟DC 分化為成熟DC(mature DC)，此時(shí)DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可極強(qiáng)的激活T 細(xì)胞。

2. CIK 培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：

CD3 激發(fā)型單抗：

CD3 分子在T 細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā)型單抗與T 細(xì)胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致T 細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使T 細(xì)胞增殖和活化。也就是說，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識(shí)別和激活過程，從而引起T 細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。

，CD3 激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號(hào)。研究表明，僅克隆號(hào)為OKT-3的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的CD3 激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T 細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK 培養(yǎng)時(shí)，最好選用OKT-3 克隆，以保證每個(gè)患者的T 細(xì)胞均能被激活。

IL-2 (白細(xì)胞介素-2)
IL-2 最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子。IL-2 既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過與T細(xì)胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2 還可刺激NK 細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖與活化。

IFN-γ (干擾素-γ)
IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用，因此會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。

IL-1α(白細(xì)胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型CD3 單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK 的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】

1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集
1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞80 - 100ml；
1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2 次，獲得純度在90%以上的PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到 1-3 x108。

2． (可選步驟) 腫瘤抗原的制備

? ? 用于負(fù)載DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。

? ? 用TSA 或TAA 負(fù)載的DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC 可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r(shí)無需知道那些抗原是腫瘤細(xì)胞的TSA 或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC 可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同抗原決定簇的細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。
? ? 腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載DC 的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC、用凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC，用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載DC，和將腫瘤細(xì)胞與DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC，因該方法簡(jiǎn)單、快速、有效。反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1 手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2 無菌生理鹽水洗3 次；
2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，充分研磨；
2.4 200 目無菌網(wǎng)過濾后收集單細(xì)胞懸液；
2.5 用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml 無菌凍存管中；
2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入37oC 水浴中解凍10 min。
反復(fù)3-5 次；
注：也可以-80oC/37oC 反復(fù)凍融3-5 次。
2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
2.8 收取上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測(cè)蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體；
2.9 -80oC 保存?zhèn)溆谩?/span>

3． CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
3.1 步驟1 中獲得的PBMC 用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；
3.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細(xì)胞貼壁;
3.3 收集懸浮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養(yǎng)；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；
注：此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml 的重組人IL-1α。
3.6 每3 天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；
3.7 在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK 細(xì)胞，此時(shí)數(shù)量應(yīng)達(dá)到1x 109 個(gè)以上。
3.8 CIK 細(xì)胞質(zhì)控：
3.8.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
3.8.2 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8 和CD56 等分子的表達(dá)，觀察CD3+CD56+細(xì)胞的比例是否明顯提高。

4． DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
4.1 步驟3.2 中剩下的貼壁細(xì)胞(主要是CD14+的單核細(xì)胞)，加入含重組人GM-CSF500-1,000U/ml 和重組人IL-4 500U/ml 的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC 細(xì)胞分化；
4.2 每3d 半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；
4.3 (可選步驟) 在培養(yǎng)的第5d，加入步驟2 中獲得的腫瘤抗原50 μg/ml，對(duì)DC 進(jìn)行抗原負(fù)載；
注：若不對(duì)DC 進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。
4.4 在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-α(500U/ml)，誘導(dǎo)DC 細(xì)胞成熟；
4.5 在培養(yǎng)的第7d 或第8d，收獲DC 細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×106 個(gè)以上；
4.6 DC 的質(zhì)檢：
4.6.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
4.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC 細(xì)胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達(dá)，以確定DC 是否成熟。

5. DC-CIK 細(xì)胞的制備和質(zhì)檢
5.1 收集步驟4 和步驟3 中所獲得的DC 細(xì)胞和CIK 細(xì)胞，按1∶10 (數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3 天半量換液一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 (300U/ml)。
5.3 在第7d 收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×1010 個(gè)以上；
5.4.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
5.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。
5.4.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以DC-CIK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 104 個(gè)，終體積為200 μl，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。
5.4.4 收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【DC-CIK?培養(yǎng)試劑推薦】

DC-CIK 細(xì)胞的制備方法

注：Animal Free 意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛的病原體和蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中最好使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子。

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