蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)保姆級(jí)教程 Part 2:解決WB的疑難雜癥

2024-08-06

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?背景有黑點(diǎn)，怎么辦？?詳情信息

1、封閉液未溶完全
解決：
A.確認(rèn)BSA/牛奶有完全溶解，建議增加溶解時(shí)間或溶解后取上清液使用。
B.利用0.45um濾紙過(guò)濾溶液，也可使用商品化試劑，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent，適用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA）。

C.改變緩沖液，如換為BSA。

2、溶液污染
解決：

使用現(xiàn)配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商業(yè)化溶液減少因長(zhǎng)菌長(zhǎng)霉造成的黑點(diǎn)。

3、封閉液及抗體交互作用

解決：
一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會(huì)與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合。因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時(shí)洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點(diǎn)高背景的情況。

?過(guò)曝，怎么辦？?詳情信息
1、蛋白樣品過(guò)量
解決：

降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高（如β-actin），此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。

2、抗體過(guò)量
解決：
A.增加抗體稀釋倍數(shù)。
B.減少孵育時(shí)間，一般孵育時(shí)間為37℃，1小時(shí)。

C.于4℃過(guò)夜孵育，減少抗體非特異性結(jié)合。

3、訊號(hào)過(guò)曝
解決：
A.縮短曝光時(shí)間。
B.使用低靈敏的ECL。

?拖帶，怎么辦？?詳情信息
1、樣品不純，有雜質(zhì)污染
解決：
A.重新離心樣品，取上清液使用。
B.使用較純的試劑配制細(xì)胞裂解液或購(gòu)買商業(yè)化產(chǎn)品。
C.使用Benzonase?核酸酶，Benzonase?核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對(duì)跑膠的干擾。

D.全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取，使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。

2、蛋白樣品過(guò)量
解決：
A.降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。

B.蛋白變性不完全，也會(huì)使條帶成團(tuán)拖曳；此時(shí)，可通過(guò)延長(zhǎng)樣品加熱時(shí)間(一般約5分鐘)及調(diào)整SDS(一般是2 %)比例，使蛋白變性更完全。

3、訊號(hào)過(guò)曝
解決：
A.縮短曝光時(shí)間。
B.使用低靈敏的ECL。

?條帶扭曲，怎么辦？?詳情信息
1、膠沒配好
解決：
A.確保APS＆TEMED正常，并新鮮配制膠體。

B.空的泳道加Sample Buffer

2、電流電壓?jiǎn)栴}
解決：

避免膠體過(guò)熱。電壓過(guò)高也會(huì)出現(xiàn)微笑、歪斜條帶等條帶，建議上層濃縮膠使用80V；下層分離膠使用100-120V。另外也需檢查電泳槽是否有銹蝕造成電流不穩(wěn)。過(guò)熱時(shí)可改為在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳。

3、轉(zhuǎn)膜問題
解決：
小心滾壓膠體并確保與膜貼合，有時(shí)出現(xiàn)?2個(gè)條帶是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時(shí)不小心移動(dòng)到膜產(chǎn)生疊影。

?高背景，怎么辦？?詳情信息
1、封閉問題
解決：
A.確認(rèn)封閉完全。封閉作用不足，這是其中一種可能的原因，提高封閉物濃度可確保封閉液完全覆蓋轉(zhuǎn)印膜，如使用5%?脫脂奶粉或BSA。
B.封閉液不與抗體反應(yīng)。這種情況較常發(fā)生在磷酸化抗體的使用過(guò)程中，由于牛奶含有casein這種磷酸蛋白，因此如果使用牛奶當(dāng)封閉液，封閉液與磷酸化抗體可能會(huì)產(chǎn)生非特異性的結(jié)合。這個(gè)情況下，建議使用BSA作為封閉液，同時(shí)搭配使用TBST的洗脫液來(lái)幫助降低高背景值的狀況。

C.封閉時(shí)間增加，一般情況會(huì)使用室溫37度封閉1小時(shí)，可視情況調(diào)整封閉的條件。

2、膜的問題
解決：
A.選擇合適的膜（可參考詳情信息）
B.膜干掉，建議整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都須注意讓膜保持濕潤(rùn)，特別是PVDF膜。

C.膜沒有完全均勻濕透，PVDF膜較會(huì)出現(xiàn)這個(gè)狀況，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸潤(rùn)膜。

3、抗體問題
解決：
A.降低抗體濃度
B.以陽(yáng)性對(duì)照確認(rèn)二抗

C.足夠的洗脫時(shí)間和次數(shù)

4、呈色問題
解決：
ECL呈色問題造成高背景值的原因，可能是因?yàn)榛瘜W(xué)顯色底物過(guò)多；建議按說(shuō)明書加入適量的顯色底物。

?非特異性條帶，怎么辦？?詳情信息
1、蛋白降解
解決：
A.加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。
B.冰上操作。

C.避免反復(fù)凍融樣品（建議分裝）；建議使用新鮮制備的樣品。

2、蛋白形成多聚體

解決：
A.使用現(xiàn)配的DTT/2-ME并將加熱時(shí)間延長(zhǎng)，幫助打斷多聚體的雙硫鍵。

B.樣本煮沸溫度達(dá)到95℃-100℃。

3、確認(rèn)蛋白特性
解決：

查詢生物信息是否有后修飾、剪切體等。

4、抗體濃度過(guò)高/蛋白樣品過(guò)量
解決：
A.增加抗體稀釋倍數(shù)，也可調(diào)整孵育時(shí)間，并在4℃孵育。

B.減少上樣量。

5、抗體非特異性結(jié)合
解決：
A.增加洗膜次數(shù)與時(shí)間或在洗滌液里改用不同強(qiáng)度的detergent或是增加濃度。

B.設(shè)對(duì)照組來(lái)確認(rèn)抗體非專一性結(jié)合可能的原因，例如：是否有目標(biāo)蛋白表達(dá)。

6、抗體檢測(cè)到heavy/light chain的信號(hào)
解決：
這種情況通常發(fā)生在IP實(shí)驗(yàn)里，GeneTex有一系列可避免辨認(rèn)heavy/light chain的特制二抗，其設(shè)計(jì)原理是用來(lái)辨認(rèn)native的一抗結(jié)構(gòu)。（可參考詳情信息）

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