ELISA是什么？

Emzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),又稱為酶聯(lián)免疫吸附分析法，是抗體應用的實驗方法之一，主要用于檢測抗體與抗原的專一性、親和力，又或者是樣本中特定抗原或抗體的含量等等。實際應用層面廣泛、步驟也不復雜，是許多實驗室與研究單位常用的檢測方法。

ELISA怎么做？

ELISA實驗流程可整合為包被（Coating）、封閉（Blocking）、檢測（Detection）、讀?。≧eading）四大步驟：

（1）包被：將抗原或抗體固著在微孔板上；

（2）封閉：阻斷非專一結(jié)合作用；

（3）檢測：利用酵素呈色以檢測抗體與抗原的結(jié)合；

（4）讀取：分析呈色狀況以定性定量抗體抗原結(jié)合程度。

ELISA也有好幾種？

依實驗目的及流程不同，ELISA的應用大致可以分為四種：直接ELISA（Direct ELISA）、間接ELISA（Indirect ELISA）、夾心ELISA（Sandwich ELISA）、競爭ELISA（Competitive ELISA）。（Refer 1）

（1）直接ELISA：先將抗原包被于微孔板上，封閉之后再直接加入酶聯(lián)一級抗體，洗去多余抗體后加入基質(zhì)呈色。由于步驟相對簡單，在節(jié)省實驗時間與降低人因失誤上較具優(yōu)勢，也能避免二級抗體交叉作用帶來的影響。但是直接ELISA也有事前的一級抗體酶聯(lián)加工費工費時、缺乏實驗適用彈性、無法放大訊號與多重標定耗時等缺點。主要用于檢測樣本中特定抗原定性定量、抗原表位定位以及篩檢抗體等用途。

(2) 間接ELISA: 步驟大致與直接ELISA類似，但由于間接ELISA使用了酶聯(lián)二級抗體，抗體與抗原的結(jié)合訊號得以被放大、敏感度也增加，而且還具有良好的實驗適用彈性，是很常被使用的ELISA種類。

(3) 夾心ELISA: 顧名思義，是將抗原夾于兩種抗體之間的方法。先將捕捉抗體(Capture antibody) 包被于微孔板上，封閉后加入抗原與其結(jié)合，再次封閉后再加入辨認不同表位的檢測抗體(Detection antibody)。依檢測抗體是否酶聯(lián)或使用二級抗體，夾心ELISA也可細分為直接與間接法。由于使用雙重一級抗體，夾心ELISA具有相當高的訊號專一性以及實驗適用彈性。主要使用于檢測大分子抗原，也適用于純度較低的樣本檢測，如血液或食物等。

(4) 競爭ELISA:主要是利用外加抗原或抗體與事先包被并已結(jié)合好的抗體與抗原競爭的方法。隨著外加濃度增加，事先結(jié)合的抗體抗原會逐步被取代?？梢砸缹嶒災康拿嘎?lián)于不同的抗原或抗體上，以利最后的訊號解讀與比對，適用性相當廣泛。主要用來檢測樣本中的小分子抗原含量或特定抗體含量。

ELISA種類原理圖

Genetex產(chǎn)品介紹之ELISA的變化與應用

近來Genetex推出了相當多的感染疾病檢測試劑，以SARS-CoV-2的中和抗體檢測試劑為例，說明ELISA的實際應用范例。

(1) Omicron變異株中和抗體檢測試劑 (SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit (Omicron BA.1 / BA.2 / BA.4 / BA.5)(GTX537233))

SARS-CoV-2透過棘蛋白(spike protein)與宿主細胞表面的ACE2蛋白結(jié)合以進入細胞。中和抗體可以干擾此作用、抑制SARS-CoV-2感染，因此被許多專家認為是病人存活與免疫防護的關鍵 (Ref 2)。免疫防護的強度與期限對于流行病學研究、公共衛(wèi)生措施以及疫苗策略制定等是相當重要的議題 (Ref 3, 4)。相對于傳統(tǒng)病毒感染抑制法，高通量的免疫分析可以更有效率的協(xié)助檢測有效的中和抗體并繪制其效力相關曲線 (Ref 5)。

GeneTex新開發(fā)的試劑是利用競爭ELISA的原理來檢測樣本中的中和抗體濃度。包被于微孔板上的ACE2蛋白會先與標記His-tag的棘蛋白結(jié)合。值得注意的是，盡管RBD (receptor-binding domain)被認為是棘蛋白用來與ACE2結(jié)合的主要區(qū)域，但無法排除其他相鄰區(qū)域以及多體結(jié)構(gòu)對于感染的影響。為了更加貼近真實情況，試劑中采用了三體結(jié)構(gòu)的棘蛋白。當陽性對照組或帶有中和抗體的樣本加入后，棘蛋白對ACE2的結(jié)合將會受到干擾而脫離，剩余的部分則可以被酶聯(lián)His-tag抗體辨認并用于后續(xù)呈色。因此，當中和抗體效力越強、濃度越高，棘蛋白越容易脫落，最終呈色越淡；反之則顏色越深。

GeneTex新型冠狀病毒中和抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑套組 (Omicron BA.1 / BA.2 / BA.4 / BA.5 變異株) (GTX537233)

檢測試劑套組的中和抗體陽性對照組來自于SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody [HL1003] (GTX635792) (104-13333 pM) (左圖)以及SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Omicron antibody [HL1867] (GTX637592) (104-13333 pM) (右圖)來自兩支棘蛋白受器結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體的混合物，不只可以抑制野生株，也能抑制Omicron子變異株(BA.1、BA.2、BA.4與BA.5)的棘蛋白與宿主受器ACE2的結(jié)合。

(2) 側(cè)向流動分析 (Lateral flow-based neutralization assay)

側(cè)向流動分析也是廣義的競爭ELISA原理應用，也可以用來作為中和抗體濃度檢測的工具。棘蛋白與ACE2抗體事先分別包被于快篩試片的測試線 (Test line)與對照線 (Control line)上。當陰性樣本加入后，標記膠體金的ACE2蛋白會沿著試片擴散，并被測試線與對照在線的棘蛋白RBD與ACE2抗體攔截，于試片上呈現(xiàn)雙紅線。當帶有中和抗體的樣本加入后，原先被攔截的ACE2蛋白則會因為中和抗體的競爭而無法停留形成紅線。

利用側(cè)向流動分析篩檢新冠病毒中和抗體濃度。新冠病毒中和抗體能夠利用競爭的方式，干擾棘蛋白RBD與ACE2蛋白的結(jié)合，而使得測試線(T線)上的膠體金標定ACE2蛋白脫離，而無法呈現(xiàn)紅色的T線。反之，陰性對照組則因為膠體金標定ACE2蛋白與棘蛋白RBD以及ACE2抗體的結(jié)合，而分別停留在T線與C在線(對照線)。

(3) SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit(GTX536267)

GeneTex設計了一系列針對SARS-CoV-2棘蛋白不同表位的重組單株抗體，這些抗體除了通過專一性驗證之外，也進行了不同排類組合的測試，為的是找出最適合應用于直接夾心ELISA的捕捉抗體與檢測抗體配對。

SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit (GTX536267)試劑組中，利用事先包被于微孔板上的棘蛋白RBD鼠單株抗體做為捕捉抗體，與陽性對照組的棘蛋白S1或與樣本中的目標抗原結(jié)合。在洗去多余的抗原之后，再以酶聯(lián)抗體進行第二次辨認。依樣本中的目標抗原多寡而有呈色濃度的差異。經(jīng)過充分的實驗測試，這組棘蛋白RBD夾心ELISA試劑被證實可適用于辨認SARS-CoV-2原始病毒株以及數(shù)種被關注監(jiān)測的變異株的重組棘蛋白RBD，包括: Alpha (B.1.1.7, B.1.1.7 with E484K)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B1.617.2)、Kappa (B.1.617.1)以及Omicron (BA.1, BA.2, BA.4, BA.5, BF.7, BQ.1與XBB)。

夾心ELISA試劑套組SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD Protein Sandwich ELISA Kit (GTX536267)應用于辨識新冠病毒野生株與不同變異株的重組棘蛋白RBD。

GeneTex為推動新冠病毒研究發(fā)展，提供了多樣化且經(jīng)充分驗證的檢測試劑套組、抗體、重組蛋白等清單。欲了解相關產(chǎn)品，請參考以下重點商品、相關文宣品或造訪我們的網(wǎng)站www.genetex.com以獲取更多信息。

重點產(chǎn)品

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1.掛圖: 新冠病毒

2.掛圖: 黃病毒

3.掛圖: 流行性感冒病毒

4.單頁: 病毒宿主交互作用

5.單頁: 黃病毒

6.單頁: 甲型與乙型流行性感冒病毒重組抗體

參考文獻

1.Nat Commun. 2021 May 11;12(1):2670. doi: 10.1038/s41467-021-22958-8.

2.PLoS Med. 2022 May 17;19(5):e1003991. doi: 10.1371/journal.pmed.1003991.

3.Nat Med. 2022 Mar;28(3):496-503. doi: 10.1038/s41591-022-01715-4.

4.J Med Virol. 2022 Jan;94(1):388-392. doi: 10.1002/jmv.27287.

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