RIG-I 與 STING 的聯(lián)盟
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天然免疫系統(tǒng)對于限制病毒感染作用重大。其依靠若干組模式識別受體（PRRs）來識別病毒核酸¹。這些PRRs包括胞漿DNA感受器（CDS），環(huán)鳥苷酸腺苷酸合成酶（cGAS），和細(xì)胞質(zhì)RNA感受器視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）。這些受體一旦被活化，將誘導(dǎo)不同的信號通路導(dǎo)致一系列抗病毒分子的產(chǎn)生。有趣的是，有證據(jù)表明，這些信號通路之間存在緊密聯(lián)系以增強抗病毒反應(yīng)。
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感受器cGAS和RIG-I通過單獨的接頭蛋白來識別不同的核酸和信號。cGAS感受細(xì)胞質(zhì)中異常DNA的存在和濃度，而后通過環(huán)二核苷酸2’3’-cGAMP²募集干擾素基因刺激因子（STING, or MITA/ERIS/MPYS）。RIG-I檢測出5`-二/三磷酸末端未加帽的病毒RNA和短平末端雙鏈部分的病毒RNA后，其與線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS, or IPS-1/VISA/Cardif)1結(jié)合。它們激活后，cGAS/STING和RIG-I/MAVS將觸發(fā)共同的信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致I型干擾素（IFNs）和促炎性因子的產(chǎn)生。

在不同水平上均有報道稱RNA和DNA通路之間存在復(fù)雜的相互作用。首先，若干組數(shù)據(jù)表明在人源細(xì)胞中，胞漿中富含AT的DNA以一種RIG-I/MAVS依賴的方式導(dǎo)致了I型干擾素的產(chǎn)生，而在小鼠細(xì)胞中則沒有^3-5。雖然RIG-I和dsDNA之間顯示有直接的相互作用6，但是RIG-I的這種識別作用需要poly(dA:dT)通過RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄作用實現(xiàn)^4,5。此外，在STING缺失細(xì)胞中，應(yīng)答胞漿雙鏈RNA和病毒感染時I型干擾素產(chǎn)量的減少和免疫共沉淀實驗中STING和RIG-I的直接結(jié)合共同證明STING參與RIG-I/MAVS應(yīng)答途徑^7,8。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，STING作為共同接頭蛋白與MAVS在線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）形成復(fù)合物，從而活化RIG-^I7,9。此外，cGAS參與反轉(zhuǎn)錄病毒RNA10和胞漿RNA：DNA雜合體的識別¹¹，并在晶體結(jié)構(gòu)研究中顯示其與合成RNA結(jié)合¹²。

除調(diào)節(jié)器與RNA和DNA途徑物理上的互作之外，STING和RIG-I表達水平上的協(xié)同調(diào)節(jié)也有描述。事實上，合成的或病毒激動劑激活RIG-I后可誘導(dǎo)STING表達¹³，反之亦然，STING活化的下游信號通路可誘導(dǎo)RIG-I的表達，有趣的是，上調(diào)的RIG-I參與STING表達的負(fù)反饋調(diào)節(jié)以防止過度的免疫反應(yīng)¹⁴。

總之，cGAS/STING和RIG-I/MAVS在生理和功能上是相互聯(lián)系的。RNA和DNA檢測中的互作和隨后的信號級聯(lián)反應(yīng)在應(yīng)對微生物核酸的多樣性和抵抗病毒逃逸機制上都是至關(guān)重要的。此外，RIG-I和STING之間的互作可能有助于平衡細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)和自身節(jié)律。值得注意的是，RIG-I和STING之間的互作在物種和細(xì)胞類型之間差異很大，這可能反映了病毒及其目標(biāo)細(xì)胞間的協(xié)同進化作用。核酸感應(yīng)途徑的激動劑或抑制劑的未來發(fā)展需要嚴(yán)格檢查其對每個核酸感受器的影響。

RIG-I 信號通路
RIG-I 配體?

??5’ppp-dsRNA
5’ppp-dsRNA 是一種5’三磷酸雙鏈RNA，通過一個由19個核酸分子通過磷酸二酯鍵聚合成的5`三磷酸單鏈RNA和其非三磷酸互補鏈雜交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通過篩選各種序列突變體確定。未加帽的5’三磷酸雙鏈RNA能夠被RIG-I特異性識別。

? 3p-hpRNA
3p-hpRNA是通過體外轉(zhuǎn)錄甲型流感病毒（H1N1）序列而產(chǎn)生的5’三磷酸發(fā)夾RNA。這個有87個核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和雙鏈片段，它們是RIG-I識別的特征結(jié)構(gòu)。3p-hpRNA是RIG-I的一種有效并特異性的激動劑。


RIG-I/MAVS 報告基因細(xì)胞

InvivoGen提供一系基于人源肺癌細(xì)胞株A549，小鼠巨噬細(xì)胞RAW和人源胚腎細(xì)胞HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，助力RNA感受器RIG-I信號通路的研究。這些細(xì)胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除細(xì)胞株（衍生自A549或RAW細(xì)胞系）或者RIG-I基因的過表達細(xì)胞株（衍生自HEK-293細(xì)胞系）。

? A549-Dual?

? A549-Dual? KO-RIG-I?

? A549-Dual? KO-MAVS

? HEK-Lucia? Null

? HEK-Lucia? RIG-I

? RAW-Lucia? ISG

? RAW-Lucia? ISG KO-RIG-I

? RAW-Lucia? ISG KO-MAVS

描述
所有的RIG-I/MAVS報告基因細(xì)胞系均表達一個含有分泌型熒光素酶基因ISG（干擾素刺激基因）誘導(dǎo)型構(gòu)件?；罨疪IG-I/MAVS信號通路可誘導(dǎo)ISG啟動子的活化并產(chǎn)生熒光素酶，該酶存在于細(xì)胞上清并能夠通過熒光素酶檢測試劑QUANTI-Luc?檢測定量。源于A549的細(xì)胞攜帶一個額外的NF-κB誘導(dǎo)表達分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因構(gòu)件，該酶的活性能夠通過SEAP檢測試劑QUANTI-Blue?檢測定量。
這些RIG-I/MAVS報告基因細(xì)胞株攜帶Zeocin?單抗性基因或Zeocin?和Blasticidin（參見最后一頁）雙抗性基因。

結(jié)果
使用RIG-I激動劑，復(fù)合了LyoVec?的5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual?和RAW-Lucia? ISG細(xì)胞系，ISG應(yīng)答顯著。在A549-Dual?細(xì)胞中3p-hpRNA激動性強度明顯高于5’ppp-dsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA復(fù)合物活化信號已明顯高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的復(fù)合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO細(xì)胞株中應(yīng)答消失。使用RIG-I配體刺激HEK-Lucia?對照細(xì)胞時ISG反應(yīng)很弱。而在HEK-Lucia? RIG-I細(xì)胞中，由于RIG-I基因的組成型過表達導(dǎo)致這種應(yīng)答尤為強烈。同樣，當(dāng)使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA時觀察到更高水平的ISG應(yīng)答。在衍生自A549的細(xì)胞株中NF-κB對于RIG-I配體的反應(yīng)跟ISG應(yīng)答是相似的，雖然前者更弱一些（參考網(wǎng)站數(shù)據(jù)）。



ISG對RIG-I配體的反應(yīng)：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的細(xì)胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的細(xì)胞。經(jīng)過孵育過夜，可使用QUANTI-Luc?檢測上清中Lucia熒光素酶活性的相對光單位（RLUs）以測試ISG的反應(yīng)。

相關(guān)產(chǎn)品

STING 突變株

STING SAVI 報告基因細(xì)胞株

InvivoGen提供給一系列基于人源THP1單核細(xì)胞系的STING突變體的報告基因細(xì)胞株。其中，有兩款表達STING- associated vasculopathy with onset in infancy（SAVI）的功能獲得性突變體(S154 and M155)。SAVI患者在STING蛋白中顯示出單一突變，導(dǎo)致其持續(xù)激活和ISG的過度活化。S154是新生突變1，M155是遺傳突變2。STING SAVI報告基因細(xì)胞株是篩選STING通路抑制劑便捷有力的工具。
? THP1-Dual? KI-hSTING-S154 ? ? ? THP1-Dual? KI-hSTING-M155

描述
THP1-Dual? KI-hSTING-S154細(xì)胞和THP1-Dual? KI-hSTING-M155細(xì)胞均來自THP1-Dual? KO-STING細(xì)胞，該細(xì)胞衍生自THP-1細(xì)胞，穩(wěn)定敲除了內(nèi)源性人源STING的雙等位基因并穩(wěn)定整合了兩種可誘導(dǎo)分泌的報道基因（Lucia螢光素酶和SEAP（分泌型胚胎堿性磷酸酶）。THP1-Dual? KO-STING細(xì)胞敲入了“野生型”R232人源STING突變體3的無內(nèi)含子編碼序列和一個S154 或M155突變位點。IRF3和NF-κB通路能夠通過分別測試Lucia熒光素酶或SEAP活性進行檢測。細(xì)胞培養(yǎng)上清中的報告基因蛋白活性能夠使用QUANTI-Luc? and QUANTI-Blue?檢測試劑進行檢測。SAVI報告基因細(xì)胞對Blasticidin和Zeocin?有抗性。

結(jié)果
功能獲得(Gain-of-function)的活化-THP1-Dual? KI-hSTING-S154細(xì)胞和THP1-Dual? KI-hSTING-M155細(xì)胞均均可以持續(xù)活化ISG，而THP-1-Dual? KI-hSTING-R232卻不能。加入IFN-β或STING激動劑將進一步促進ISG的活化。注意，結(jié)果已被非刺激細(xì)胞背景信號標(biāo)準(zhǔn)化。因為其持續(xù)活化STING的特性，SAVI細(xì)胞的背景非常高，誘導(dǎo)ISG應(yīng)答的增加倍數(shù)低于R232對照細(xì)胞。
抑制劑功能-加入TBK-1抑制劑BX795，或Brefeldin A，一種抑制蛋白從ER轉(zhuǎn)運到高爾基體的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，能夠顯著抑制SAVI細(xì)胞中STING信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。所以，這些細(xì)胞能夠用于篩選STING的抑制劑。

1. Munoz J. et al., 2015. Stimulator of interferon genes-associated vasculopathy with onset in infancy: a mimic of childhood granulomatosis with polyangiitis. JAMA Dermatology 151: 872-7.

2. Jeremiah N. et al., 2014. Inherited STING-activating mutation underlies a familial inflammatory syndrome with lupus-like manifestations. The Journal of Clinical Investigation 124: 5516-20.

3. Yi G. et al., 2013. Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides. PLOS ONE 8: e77846。

相關(guān)產(chǎn)品

對IFN-β或STING激動劑的ISG應(yīng)答：使用104 U/ml IFN-β, 10 μg/ml 2’3’ cGAMP或2’3’ cGAMP(PS)2(Rp/Sp), 30 μM BX795 or 10 μg/ml Brefeldin A刺激衍生自THP1-Dual?細(xì)胞。孵育過夜后，通過使用QUANTI-Luc?檢測上清中Lucia熒光素酶活性測試ISG應(yīng)答。Bar值表示非刺激細(xì)胞中背景信號標(biāo)準(zhǔn)化的活性百分比。


STING 篩選服務(wù)
InvivoGen提供一系列STING篩選服務(wù)的選擇，用于鑒定激活或抑制一些STING突變體的分子。欲知更多信息請聯(lián)系我們。?


重組人源 STING 蛋白
STING通過胞漿區(qū)域與CDNs結(jié)合。InvivoGen提供的重組STING蛋白對應(yīng)可溶性的胞漿結(jié)構(gòu)域（aa 137-379）R232突變型，是最普遍的人源STING蛋白的同型。這個27kDa的重組蛋白產(chǎn)生自哺乳動物中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO），通過親和層析純化，不帶標(biāo)簽，能夠被市面上的商品化人源STING抗體所識別。

核酸轉(zhuǎn)染試劑

LyoVec?

LyoVec?是第一個凍干的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。它由磷脂DTCPTA組成，后者可以與中性脂質(zhì)體DiPPE偶聯(lián)，增加雙層膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，從而增加LyoVec?的體外轉(zhuǎn)染效率。LyoVec?的正電荷能夠使其與DNA結(jié)合，同時其磷脂結(jié)構(gòu)能夠促進DNA運輸至與細(xì)胞膜融合。

LyoVec?，被開發(fā)為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑，能夠被有效地用于核酸絡(luò)合試劑以促進基于RNA或DNA的寡聚核苷酸，如RIG-I配體，5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA（參見第二頁）或cGAS的配體，HSV60 and VACV70進入到胞內(nèi)。這個絡(luò)合步驟是通過模式識別受體引起對核酸反應(yīng)至關(guān)重要的一步。

基因篩選抗生素
細(xì)胞培養(yǎng)測試的抗生素?
? 無菌?
? 無內(nèi)毒素?
? 驗證篩選功能

InvivoGen提供一系列細(xì)胞培養(yǎng)測試的抗生素以確保無假陰性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)哺乳動物細(xì)胞株。這些抗生素?zé)o菌且無內(nèi)毒素污染以避免細(xì)菌內(nèi)毒素，也被稱為LPS，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞造成的有害影響。InvivoGen嚴(yán)格驗證產(chǎn)品的物理化學(xué)，通過微生物和細(xì)胞培養(yǎng)以確保其功能活性。所有出品的抗生素被證實對哺乳動物細(xì)胞表現(xiàn)出長期的穩(wěn)定性并且沒有細(xì)胞毒性。

InvivoGen的篩選抗生素可與其他篩選抗生素或與細(xì)胞培養(yǎng)過程中預(yù)防支原體，細(xì)菌，真菌污染的抗微生物抗生素聯(lián)合使用。有不同的規(guī)格可供選擇。


相關(guān)產(chǎn)品